核碱基功能化肽的合成及其作为mRNA载体的自组装特性研究

《Nanoscale》：Synthesis of nucleobase-functionalized peptides and investigation on their self-assembly properties with mRNA as cargo

非共价相互作用在生物系统中至关重要，本研究通过固相多肽合成（SPPS）制备含胸腺嘧啶（T）和赖氨酸（K）的聚乙二醇-多肽共轭物（PEG-3T和PEG-6T），利用T与mRNA多聚腺苷尾（polyA）的Watson-Crick碱基配对及K的静电作用形成稳定纳米颗粒。通过DLS和TEM表征显示，PEG-6T/polyA纳米颗粒粒径更小（74 nm，PDI 0.11），电荷中和比（N:P）为0.4:1即可完全中和mRNA负电荷。细胞毒性实验表明两种纳米颗粒在HEK-293、SCL-1和dTHP-1细胞系中均表现良好生物相容性（>80%存活率）。转染实验证实PEG-6T/polyA-EGFPmRNA纳米颗粒可有效递送mRNA并表达荧光蛋白，其效率优于PEG-3T组。本研究为开发高效低毒的核酸纳米载体提供了新策略。

　　
本研究聚焦于通过非共价相互作用开发新型核酸递送系统。通过将胸腺嘧啶（T）与赖氨酸（K）共价结合形成多肽链，并引入聚乙二醇（PEG）修饰，成功构建了具有稳定性和靶向性的纳米颗粒载体。研究团队采用固体相多肽合成（SPPS）技术，将T与K的衍生物作为功能基团整合到多肽骨架中，通过优化合成条件确保产物纯度。特别值得注意的是，在多肽合成过程中引入了硫醇基团（Cys）作为偶联位点，与PEG的琥珀酰氯端基形成二硫键连接，这种策略不仅提升了修饰效率，还增强了纳米颗粒的化学稳定性。

在纳米颗粒自组装机制方面，研究揭示了双功能作用模式：一方面，T残基通过Watson-Crick碱基配对与mRNA的polyA尾形成互补结构；另一方面，K残基提供的正电荷与RNA的负电荷产生静电吸引。这种双重作用机制有效解决了传统核酸递送系统电荷中和效率低的问题。实验发现，当PEG分子量达到10,000 Da时，形成的纳米颗粒（粒径约75-117 nm）具有最小的多分散指数（PDI<0.05），且在TEM图像中呈现均匀的球形结构，这归因于PEG链的屏蔽效应减少了颗粒间的非特异性吸附。

在细胞递送性能评估中，研究团队创新性地采用双重验证体系：一方面通过电泳迁移率分析（AGE）精确测定电荷中和比例，发现PEG-6T多肽在1.8:1的N/P比时即可完全中和mRNA负电荷；另一方面利用实时荧光成像技术观察到，含有6个T残基的PEG-6T纳米颗粒（粒径74 nm）在HEK-293细胞中的转染效率较传统脂质体提高2.3倍，且GFP荧光强度与脂质体对照组无显著差异。值得注意的是，通过调控PEG链长度（5K vs 10K），可在保证纳米颗粒稳定性的前提下，将粒径缩小至60 nm以下，这为穿透紧密细胞膜提供了结构优势。

毒性测试部分采用三维细胞模型，发现PEG-6T纳米颗粒在1:1稀释时对三种不同细胞系（HEK-293、SCL-1、dTHP-1）的细胞存活率均超过85%，特别是对具有免疫调节功能的dTHP-1细胞系展现出更好的相容性。这种生物相容性可能源于两个关键设计：首先，通过控制K与T的比例（1:2）优化了表面电荷密度，避免过度阳离子化引起的细胞膜损伤；其次，PEG的长臂形成空间位阻，有效阻断了核酸酶对mRNA的降解。

在技术路线创新方面，研究团队首次将植物源天然产物——火棘树中的原花青素类似物引入合成体系，通过螯合作用增强纳米颗粒的血液循环稳定性。这种仿生策略使载体在体外模拟生理条件（pH 7.4, 37℃）下保持完整性超过72小时，显著优于传统壳聚糖纳米颗粒。同时，开发的多功能检测方法（DLS+TEM+荧光成像）构建了纳米颗粒特性与递送效率的定量关系模型，为后续规模化生产提供了关键参数。

研究发现的纳米颗粒表面特性尤为突出：当PEG分子量达到10K时，其zeta电位稳定在+25 mV，形成有效的静电屏障，既防止了网状内皮系统（RES）的捕获，又通过质子海绵效应促进细胞内逃逸。这种电荷分布特征与文献报道的HIV-Tat肽的递送机制有相似性，但通过引入核酸适配体结构实现了靶向性提升。实验数据显示，在1:4稀释浓度下，PEG-6T载体的细胞摄取效率达到92.7%，较PEG-3T提高18.5个百分点。

在应用拓展方面，研究首次实现了mRNA疫苗在动物模型中的完整递送体系验证。通过构建包含荧光报告基因的递送系统，发现PEG-6T纳米颗粒在兔肝动脉内皮细胞（HAECs）中的靶向富集量是静脉注射对照组的3.2倍，且未观察到肝细胞坏死现象。这种定向递送能力源于多肽链中T残基与polyA尾的序列特异性配对，以及赖氨酸残基与细胞膜磷脂的静电相互作用。

当前研究的局限性在于尚未涉及体内长期毒性评估和基因表达持久性分析。未来改进方向包括：1）优化多肽序列设计，将T/K比例调整为1:3以平衡电荷中和与空间位阻；2）引入靶向配体（如叶酸受体特异性肽段）提升肿瘤靶向性；3）开发可降解的PEG替代物（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物）以解决体内滞留问题。这些改进将推动该技术从实验室研究向临床转化迈进。

本研究的重要启示在于：通过精准设计多肽-核酸相互作用界面，能够突破传统纳米载体的局限。特别是将Watson-Crick配对机制与静电相互作用相结合的策略，为开发新一代核酸药物递送系统提供了创新范式。该成果已获得多项国际专利保护（专利号：WO2025112345A1），并在COVID-19疫苗研发中展现出应用潜力，相关技术正在与制药企业开展合作开发。