程序性细胞死亡通路协调斑马鱼中性粒细胞与巨噬细胞清除并被鼠伤寒沙门氏菌差异性利用

《Cell Death & Disease》：Programmed cell death pathways coordinate neutrophil and macrophage clearance in zebrafish and are differentially exploited by Salmonella Typhimurium

本研究针对细菌感染中免疫细胞死亡机制不清的问题，聚焦程序性细胞死亡(PCD)通路在斑马鱼模型中的作用机制。研究发现鼠伤寒沙门氏菌(ST)通过T3SS差异性激活Nlrp3/Gsdme介导的焦亡和Caspase-3依赖的凋亡清除中性粒细胞，而通过Ripk1依赖的坏死性凋亡清除巨噬细胞。该研究揭示了病原体逃逸先天免疫的新机制，为胞内菌感染治疗提供了新靶点。

　　

在生命体与病原体漫长的博弈过程中，免疫细胞的生与死决定着感染的结局。中性粒细胞和巨噬细胞作为先天免疫的先锋部队，其及时清除对于控制炎症、维持机体稳态至关重要。然而，在诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium, ST)这类胞内细菌感染中，病原体如何操控免疫细胞的死亡程序以逃逸宿主防御，其具体机制仍不甚清晰。理解不同程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)通路——包括焦亡(pyroptosis)、凋亡(apoptosis)和坏死性凋亡(necroptosis)——在免疫细胞周转和宿主防御中的精细调控与相互影响，对于开发对抗耐药性细菌感染的新策略具有重大意义。传统的哺乳动物模型虽然提供了大量信息，但在实时、原位观察整个生物体内免疫细胞动态方面存在局限。

近日，发表在《Cell Death & Disease》上的一项研究，利用斑马鱼这一模式生物的优势，深入揭示了ST如何差异性利用不同的PCD通路来清除中性粒细胞和巨噬细胞，从而颠覆了我们对感染过程中免疫细胞命运调控的认知。斑马鱼胚胎通体透明，便于进行高分辨率的活体成像，且其遗传操作简便，先天免疫系统在进化上高度保守，使其成为研究宿主-病原体相互作用的理想平台。

研究者们运用了多项关键技术：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了nlrp3、gsdmea/gsdmeb、ripk1、casp3a等基因敲低的斑马鱼模型；通过显微注射技术将野生型ST或其III型分泌系统(Type III Secretion System, T3SS)缺陷的SPI-1/SPI-2双突变菌株导入斑马鱼幼虫的卵黄囊或耳囊；采用Tg(lyz:dsRED)和Tg(mfap4:Tomato)等转基因荧光报告鱼系，在体观察和定量中性粒细胞与巨噬细胞的募集与数量变化；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测炎症因子基因表达；使用荧光底物法测定Caspase-1(Casp1)活性；通过TUNEL染色结合全胚免疫组化(Whole-mount Immunohistochemistry)检测细胞死亡；并应用药理学抑制剂（如Z-DEVD-FMK抑制Caspase-3，Ac-LEHD-CMK抑制Caspase-9，Necrostatin-2抑制Ripk1）特异性阻断不同PCD通路。

Salmonella Typhimurium kills zebrafish neutrophils, but not macrophages, by Nlrp3/Gsdme-mediated pyroptosis

（鼠伤寒沙门氏菌通过Nlrp3/Gsdme介导的焦亡杀死斑马鱼中性粒细胞而非巨噬细胞）

研究首先聚焦于炎症小体(inflammasome)通路。敲低Nlrp3或Gsdme（斑马鱼中Gasdermin E的同源物）均导致斑马鱼对ST感染更易感，表明Nlrp3-Gsdme轴对宿主防御至关重要。活体成像显示，在稳态和感染早期，Nlrp3或Gsdme缺陷均导致中性粒细胞和巨噬细胞数量增多，说明该通路参与这两种细胞的稳态周转。然而，在ST感染后，野生型幼虫的中性粒细胞数量在3和6小时 post-infection (hpi) 显著下降，而这种下降在Nlrp3或Gsdme缺陷幼虫中被阻断，意味着ST特异性地利用Nlrp3-Gsdme介导的焦亡来清除中性粒细胞。相反，巨噬细胞的数量在感染后期同样减少，但这种减少不依赖于Nlrp3或Gsdme。TUNEL染色进一步证实，ST感染诱导的细胞死亡是Nlrp3依赖性的，并且特异性发生在中性粒细胞上。

Zebrafish neutrophil and macrophage cell death depends on Type 3 Secretion System of Salmonella Typhimurium

（斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞死亡依赖于鼠伤寒沙门氏菌的III型分泌系统）

为了探究ST的毒力因子，研究比较了野生型ST和其T3SS缺陷的SPI-1/SPI-2双突变体。结果显示，突变体感染的幼虫存活率显著更高，引发的炎症反应和Casp1活性也更低。虽然突变体仍能引发免疫细胞向感染部位的募集，但它无法像野生型ST那样导致中性粒细胞和巨噬细胞总数在感染后期（3和6 hpi）下降。这明确表明，ST通过其T3SS来驱动炎症小体介导的免疫细胞杀伤。

Salmonella Typhimurium also kills zebrafish neutrophils, but not macrophages, by apoptosis

（鼠伤寒沙门氏菌也通过凋亡杀死斑马鱼中性粒细胞而非巨噬细胞）

接下来，研究探讨了凋亡的作用。使用Caspase-3(Casp3)抑制剂Z-DEVD-FMK处理，或基因敲低casp3a（斑马鱼中性粒细胞中表达的Casp3同源物），均提高了幼虫的存活率，并增加了稳态和感染条件下中性粒细胞的数量，表明凋亡参与中性粒细胞的稳态清除，且ST也利用此途径杀死中性粒细胞。此外，通过过表达凋亡抑制蛋白Icad（抑制Caspase-activated DNase, Cad）或使用Caspase-9抑制剂Ac-LEHD-CMK，证实了内在凋亡途径的参与。然而，抑制Casp3并不能阻止ST感染导致的巨噬细胞数量减少，提示巨噬细胞的清除不依赖于Casp3介导的凋亡。

Salmonella Typhimurium kills zebrafish neutrophils and macrophages by necroptosis

（鼠伤寒沙门氏菌通过坏死性凋亡杀死斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞）

鉴于巨噬细胞的死亡不依赖于焦亡和凋亡，研究者将目光转向坏死性凋亡。使用Ripk1抑制剂Necrostatin-2处理或基因敲低ripk1，均能提高宿主存活率。分析发现，抑制Ripk1增加了稳态下的中性粒细胞数量，并在感染后部分延缓了其减少，提示坏死性凋亡参与中性粒细胞的基底周转和感染诱导的死亡。更重要的是，抑制Ripk1显著增加了稳态和感染条件下的巨噬细胞数量，表明ST主要通过Ripk1依赖的坏死性凋亡来清除巨噬细胞。同时抑制凋亡和坏死性凋亡并未产生叠加保护效应，暗示这些通路可能存在交叉或收敛。

该研究的讨论部分对上述发现进行了整合与深化。首先，研究者强调了斑马鱼模型在同时、原位解析不同PCD通路于稳态和感染条件下在特定免疫细胞中作用的独特价值。研究揭示，在稳态下，焦亡、凋亡和坏死性凋亡共同协调斑马鱼幼虫中性粒细胞和巨噬细胞的周转。ST感染初期会触发一种T3SS非依赖的紧急髓系造血(emergency myelopoiesis)反应，导致髓系细胞数量暂时增加。但病原体迅速通过其T3SS进行反击：它利用Nlrp3介导的焦亡和Casp3依赖的凋亡来杀死中性粒细胞，同时利用Ripk1依赖的坏死性凋亡来清除巨噬细胞。尤为重要的是，虽然阻断焦亡可以防止中性粒细胞损失，但由于其同时损害了细菌清除能力，反而增加了宿主易感性；而抑制对控制感染非必需的凋亡或坏死性凋亡，则能增强宿主抵抗力。这揭示了不同PCD通路在宿主防御中的功能异质性，并提示它们作为治疗靶点的潜力差异。

综上所述，这项研究精确描绘了ST在斑马鱼体内差异性劫持PCD通路以瓦解先天免疫的精细策略：中性粒细胞遭遇了焦亡、凋亡和坏死性凋亡的“组合拳”，可能触发了类似“潘托西斯”(panoptosis)的细胞死亡模式；而巨噬细胞则主要死于坏死性凋亡。这些发现不仅深化了对宿主-病原体相互作用复杂性的理解，更重要的是，为治疗由胞内细菌引起的、特别是对抗生素耐药的感染提供了新的思路。针对特定的、非必需的细胞死亡通路（如凋亡或坏死性凋亡）进行联合干预，或许能成为未来对抗此类感染的有效手段，为解决日益严峻的公共卫生挑战提供了有价值的视角。