唑来膦酸和抗RANKL抗体在卵巢切除小鼠模型的胫骨中对硬化素分泌的差异调节作用

《Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine, and Pathology》：Differential Sclerostin Secretion by Zoledronic Acid and an Anti-RANKL Antibody in the Tibia of an Ovariectomized Mouse Model

本研究旨在探讨抗骨吸收药物 zoledronic acid (ZOL) 和抗 RANKL 抗体 OYC1 对小鼠成骨细胞功能及骨微结构的影响差异。实验采用卵巢切除小鼠模型，通过显微CT和病理学分析发现，ZOL 和 OYC1 均有效恢复骨量，但 ZOL 降低 sclerostin 表达，而 OYC1 增加其表达，提示两者通过不同机制调控骨细胞功能，可能影响骨坏死性下颌骨骨折（MRONJ）的发生。

　　

森真耶|西泽千明|宇佐美裕|高畑聡介|松下裕隆|田中恵美子（磯村）|田中純|古吾道美彦|相川智直|宫川和昭

大阪大学牙科大学研究生院口腔颌面外科，日本吹田市565-0871

摘要

目的

研究唑来膦酸（ZOL）和核因子-κB受体激活剂配体（RANKL）抗体OYC1如何不同地影响小鼠药物相关性颌骨坏死（MRONJ）发病机制中的成骨细胞功能。

方法

九周大的去卵巢（OVX）小鼠分别接受唑来膦酸（200 μg/kg，每周两次腹腔注射，共4周）、OYC1（5 mg/kg，单次皮下注射）或生理盐水对照处理。通过微计算机断层扫描评估胫骨微结构，组织学分析成骨细胞和成骨细胞的形态，并评估成骨细胞和成骨细胞相关标记物的基因表达。使用免疫组织化学方法分析胫骨皮质骨中关键的成骨细胞衍生蛋白——骨硬化素的水平。

结果

与对照组（OVX-CTL）相比，OVX-ZOL组和OVX-OYC1组的骨体积分数（p < 0.001）、小梁厚度（p < 0.001）和数量（p < 0.001）均显著增加。OVX-ZOL组和OVX-OYC1组的成骨细胞在骨表面的活性低于OVX-CTL组。尽管成骨细胞数量没有变化，但OVX-OYC1组的Sost表达显著增加，而OVX-ZOL组则减少。OVX-OYC1组的胫骨皮质骨中骨硬化素阳性成骨细胞比例高于OVX-CTL组（p = 0.003）。

结论

唑来膦酸和OYC1均能恢复骨丢失，但对成骨细胞的作用机制不同：唑来膦酸降低Sost/骨硬化素的表达，而OYC1则增加其表达。这些发现表明唑来膦酸和抗RANKL抗体对成骨细胞功能有差异性调节作用，需要进一步研究以阐明MRONJ发病机制。

引言

抗吸收剂（ARAs）广泛用于治疗骨疾病，如骨转移、骨骼相关事件（如骨痛、病理性骨折和高钙血症）[1] [2]以及骨质疏松症[3]。抗吸收剂包括双膦酸盐（BPs）和针对核因子-κB受体激活剂配体（RANKL）的人源单克隆抗体denosumab。尽管它们的作用机制不同，但这两类药物均通过破坏骨吸收和形成之间的正常耦合来抑制破骨细胞活性并抑制骨重塑[4]。

这些药物最严重的副作用之一是药物相关性颌骨坏死（MRONJ），这仍然是口腔颌面外科领域的主要临床挑战。尽管有来自病例报告[5]、临床研究[6] [7] [8] [9]以及日本[10]和美国[11]的最新指南，但目前尚未就MRONJ的治疗达成明确共识。目前的策略主要集中在预防上，主要是因为MRONJ的病因复杂且多因素，且难以开发出可靠的动物模型。此外，尚不清楚抗RANKL抗体是否通过与双膦酸盐相似的机制引发MRONJ。

MRONJ的病理生理学特征常类似于慢性骨髓炎，在双膦酸盐治疗下，颌骨组织学表现为成骨细胞腔隙空虚，这是早期坏死变化的标志[12] [13]。最近的研究强调了成骨细胞在生理和病理条件下调节骨重塑和维持骨质量中的关键作用[14] [15] [16]。功能失调的成骨细胞会损害骨骼稳态并影响局部炎症反应[17]。然而，抗吸收剂在体内（尤其是在病理条件下，如骨质疏松症或恶性肿瘤）如何影响成骨细胞功能的机制尚未阐明。

唑来膦酸（ZOL）已被确定为MRONJ的潜在致病因子，在双膦酸盐中报告的风险最高。Denosumab也被认为具有相同甚至更高的风险。但由于denosumab是完全人源抗体，在小鼠中无交叉反应性，直接比较ZOL与RANKL中和抗体对成骨细胞影响的动物研究仍然有限。因此，本研究旨在阐明唑来膦酸（ZOL）和小鼠单克隆抗RANKL抗体OYC1（作为denosumab的替代品）如何调节与MRONJ发病机制相关的成骨细胞功能。为此，我们在绝经后骨质疏松症的OVX小鼠模型中评估了成骨细胞功能和胫骨微结构。我们假设强效的抗吸收治疗会改变成骨细胞功能并促进MRONJ的发展。为了验证这一假设，我们给OVX小鼠模型使用了唑来膦酸或抗RANKL抗体。

部分摘录

卵巢切除诱导的骨质疏松症模型小鼠

本研究使用了九周大的C57BL/6Jcl雌性小鼠（CLEA，日本）。在全身麻醉下进行双侧卵巢切除术，麻醉药物为三种药物的组合：盐酸美托咪定（0.3 mg/kg；Domitor，Nippon Zenyaku Kogyo，福岛，日本）、咪达唑仑（4 mg/kg；Dormicum，Astellas Pharma，东京，日本）和酒石酸布托啡诺（5 mg/kg；Vetorphale，Meiji Seika Pharma，东京，日本）。

抗吸收剂的给药

给药方案采用之前在OVX研究中验证的方案

胫骨近端小梁骨微结构的变化

通过微CT分析证实，OVX诱导的胫骨近端小梁骨丢失（数据未显示）。然后，我们确认OVX小鼠的小梁骨增厚是由抗吸收剂的骨保护作用引起的（图3A）。两组的治疗组比OVX-CTL组的BV/TV值显著更高，OVX-ZOL组和OVX-OYC1组之间的BV/TV值也有显著差异（p = 0.043；图3B）。Tb.Th和Tb.N

讨论

OVX小鼠模型被广泛用作研究绝经后骨质疏松症病理生理学的临床前模型[20]。唑来膦酸通过直接抑制破骨细胞分化起作用，而denosumab和OYC1则通过阻断成骨细胞/成骨细胞产生的RANKL来干扰破骨细胞的分化和功能。在本研究中，唑来膦酸和抗小鼠RANKL抗体（OYC1）均有效恢复了OVX诱导的骨丢失（图3）。然而，它们

结论

抗吸收剂可以恢复OVX诱导的骨丢失；然而，唑来膦酸和抗RANKL抗体对成骨细胞的功能有差异性调节作用，尤其是通过改变骨硬化素的表达。这些发现进一步表明，成骨细胞活性的变化先于成骨细胞的抑制，并增加了发生MRONJ的风险。需要进一步研究以阐明这些观察结果背后的精确机制及其在MRONJ发展中的意义。

伦理批准

所有动物实验均符合相关伦理规定

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）青年科学家资助计划（JSPS KAKENHI，资助编号：26861717和25K02829，资助对象为K.M.）的支持。图7使用原始数据重新制作，这些数据也包含在提交给该资助计划的研究报告中。

我们感谢Editage（http://www.editage.jp）提供的英语语言编辑服务。

利益冲突

作者声明与本文的作者身份或发表无关的潜在利益冲突。