将多波长高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术、电化学分析方法与化学计量学相结合，用于对康福欣液体的全面质量评估

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Integrating Multi–Wavelength HPLC Fingerprinting and Electrochemical Profiling with Chemometrics for Comprehensive Quality Assessment of Kangfuxin Liquid

中药质量控制 四波长高效液相色谱电化学指纹谱法 原儿茶酸 腺苷 抗氧化活性

　　

作者：向莉、唐婷、张帆、孙国祥、侯明晓、刘云恩

沈阳医学院，沈伦国际学院（创新与创业学院），中国辽宁省沈阳市110016

摘要

康福新液（KFX）是一种复合动物源药物，由于其多组分性质和批次间差异性，在质量控制方面面临挑战。本研究提出了一种新的综合质量评估策略，结合了四波长最大化分析（Four-WMP）高效液相色谱（HPLC）和电化学指纹图谱（ECFP）技术，对KFX进行全面评估。Four-WMP方法将四个波长（236、254、265和280 nm）的色谱数据整合为统一的指纹图谱，与传统单波长方法相比显著提高了化学信息的完整性。同时，ECFP技术提供了关于KFX氧化还原活性的独特见解。通过偏最小二乘法（PLS）建模，发现化学指纹图谱与抗氧化活性之间存在强相关性（R2=0.8672，Q2=0.789），并确定了关键的质量标志物，包括原儿茶酸和腺苷。观察到不同厂家之间的显著差异，尤其是在苯甲酸钠含量方面，这突显了质量的一致性问题。该多参数框架为KFX及类似复合药物的质量控制提供了全面且稳健的方法，有效建立了化学成分与生物活性之间的联系。

引言

康福新液（KFX）是从美洲大蠊（Periplaneta americana）干燥体中提取的乙醇制剂[1]。它在临床实践中被广泛用于促进血液循环、滋养阴液和促进组织再生[2]、[3]、[4]、[5]。内服时，KFX可用于治疗血瘀、伴有出血的胃痛、胃和十二指肠溃疡，以及作为肺结核和阴虚的辅助疗法。外用时，它可用于伤口、溃疡、瘘管、烧伤和压疮的愈合。作为一种含有多种生物活性成分的治疗剂，KFX在伤口愈合和组织修复中起着重要作用。然而，生产过程中的不一致性和易受微生物污染的特点常常导致批次间质量差异[6]。尽管定量特定生物活性成分（如多酚和氨基酸）是有用的，但对KFX多组分矩阵的全面质量控制仍然具有挑战性。

目前关于KFX的研究主要集中在总氨基酸的鉴定和定量上[7]。色谱指纹图谱技术已被认为是评估复杂产品质量的有效方法[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。其中，高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术已得到广泛应用[13]、[14]、[15]、[16]。然而，传统的HPLC方法通常依赖单波长检测，可能无法捕捉到仅在其他波长下可检测到的显著峰，导致化学信息不完整。此外，以往关于KFX生物活性的研究往往忽略了抗氧化成分的作用，而这些成分对其治疗效果至关重要[17]。

为了克服这些限制，本研究提出了一种基于系统量化指纹图谱方法（SQFM）的创新质量评估策略。我们采用了两种互补的方法来生成全面的指纹图谱：四波长最大化分析（Four-WMP）和电化学指纹图谱分析（ECFP）[18]。通过DPPH自由基清除试验评估了KFX样品的总抗氧化活性。化学计量工具被用来将指纹图谱数据与抗氧化活性相关联[8]、[19]。Four-WMP方法将多个波长的显著峰整合为统一的指纹图谱，显著提高了HPLC分析的完整性和准确性。同时，ECFP通过E_os、t_ol、ΔE_max、t_oe和E_oe等参数提供了对氧化还原活性化合物的深入理解，这些参数与抗氧化性质密切相关。为了阐明化学成分与抗氧化活性之间的关系，利用HPLC和电化学指纹图谱数据构建了偏最小二乘（PLS）回归模型。这些模型表现出良好的拟合度（R2）和高预测能力（Q2），能够识别关键生物活性标志物并明确它们对抗氧化性能的贡献。图1展示了整合多波长HPLC指纹图谱、电化学分析和化学计量分析的KFX质量评估框架。

通过结合多波长HPLC分析、电化学传感和多变量建模，本研究为KFX的质量控制提供了一个稳健的多维框架。它不仅提高了质量控制的可靠性，还提供了关于KFX抗氧化活性的机制性见解，为复合动物源药物的评估提供了一种新的方法。

试剂和样品

使用配备二极管阵列检测器、四元低压梯度泵、在线脱气器和自动进样器的Agilent 1100高效液相色谱仪进行实验，数据采集由Agilent OpenLAB CDS Chemstation（版本C.01.07）工作站（Agilent Technologies, Ltd.，美国加利福尼亚州圣克拉拉）完成。分析天平包括Sartorius BS 110S（北京赛多利斯天平有限公司，中国北京）和ES-E120BⅡ电子分析天平（天津德安传感技术有限公司）。

定性和定量分析方法验证

HPLC指纹图谱的验证结果显示，在2小时空白运行期间系统未出现干扰峰，表明系统无干扰，适合进行实验。以原儿茶酸为参考峰，鉴定出17个常见的指纹图谱峰，并用于后续的方法验证。在仪器精度测试中，使用“中药色谱”方法分析了指纹图谱数据。

结论

本研究开发并验证了一种综合质量评估策略，结合了多波长HPLC指纹图谱、电化学分析和化学计量建模，系统地评估了KFX的化学成分和抗氧化性质。与以往依赖单一方法的研究不同，该策略实现了三个关键进展：通过多波长指纹图谱获取全面的化学信息；实现了功能性的生物活性评估。

资助

本文得到了中国博士后科学基金会（一般项目）（编号2024M754283）、辽宁省教育厅基金会（一般项目）（编号JYTMS20231398）和辽宁省科技厅联合基金（博士启动项目）（编号2024–BSLH–297）的支持。感谢上述基金的支持。

作者贡献声明

孙国祥：软件开发、项目管理、概念设计。 侯明晓：实验研究。 刘云恩：撰写、审稿与编辑、监督、资源获取、资金申请。 向莉：撰写初稿、数据可视化、验证、项目管理、方法学研究、数据分析、概念设计。 唐婷：方法学研究、数据分析。 张帆：实验研究、数据管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。