综述：使用微流控毛细管区电泳技术对完整单克隆抗体参考标准品进行电荷变体分析

微流控毛细管电泳-高分辨质谱联用技术快速检测单克隆抗体post-translational modifications，<15分钟完成500pg样本分析，涵盖C末端剪切、糖基化及脱酰胺等关键质量属性。

　　
单克隆抗体（mAbs）作为生物制药领域的核心治疗手段，其应用场景已从传统的小分子药物无法覆盖的疾病领域（如癌症、自身免疫疾病、心血管疾病等）扩展到高度个体化的精准医疗。然而，mAbs作为大分子蛋白（通常约150 kDa），其翻译后修饰（PTMs）的复杂性对质量控制和监管验证提出了更高要求。本研究通过开发微流控毛细管电泳-电喷雾电离高分辨质谱联用技术（CZE-ESI-MS），系统性地解析了三种USP参考级mAb的PTMs特征，为生物制药的质量分析提供了创新解决方案。

### 研究背景与意义
单克隆抗体类药物的市场规模在近十年呈现指数级增长，主要得益于其靶向治疗的优势和适应症的不断拓展。然而，mAbs的复杂结构使其易受多种翻译后修饰影响，包括：
- **N-糖基化**（覆盖超过99%的mAbs）
- **C末端赖氨酸剪切**（发生率高达95%）
- **脱酰胺**（氨基酸残基的脱酰胺反应，可能引发免疫原性）
- **唾液酸化**（糖链的唾液酸修饰影响电荷分布）

这些修饰直接影响抗体的电泳迁移率、表位可及性、药物代谢动力学特性，进而影响安全性和疗效。传统分析手段（如等电聚焦、离子交换色谱）虽能检测电荷变异，但存在分离效率低、耗时过长（30分钟至数小时）、样品需求量高等局限性。

### 创新技术与优化策略
研究团队创新性地将微流控技术引入毛细管电泳（CZE），结合高分辨质谱（Orbitrap UHMR），构建了适用于mAbs快速、高通量分析的集成系统：
1. **微流控芯片设计**：采用精密蚀刻的硅基芯片（通道长度22 cm），通过增强电场强度（500 V/cm）将分析时间压缩至10-12分钟，同时降低毛细管电泳的吸附效应和电渗流干扰。
2. **质谱参数优化**：采用高分辨率质谱（分辨率25,000以上）进行电荷状态分离，设置5微扫描、1E6 AGC增益和200 ms最大注入时间，在保证信噪比的同时提升低丰度修饰的检测灵敏度。
3. **样本处理革新**：仅需500皮克样品量，通过直接稀释原液（终浓度0.5 mg/mL）配合专用缓冲液（pH 5.5，含4% DMSO），实现免缓冲交换的一站式分析，避免传统前处理步骤可能引入的污染或降解。

### 关键研究发现
#### （1）C末端赖氨酸剪切模式
三种mAb均呈现显著的双剪切特征（-2Lys），其中：
- **USP 001**：主要剪切形式为双剪切（峰面积占比超70%），单剪切次之，完整抗体基本不可见。电泳迁移时间与理论值偏差控制在±0.5分钟内。
- **USP 002**：未检测到完整抗体峰，单剪切与双剪切比例接近1:1，可能与生产工艺差异有关。
- **USP 003**：完整抗体峰首次出现（迁移时间8.61分钟），双剪切占比约45%，单剪切约30%，表明剪切程度受制剂纯度或储存条件影响显著。

#### （2）糖基化特征分析
所有mAb均以双抗原位点（G0F/G0F）和三抗原位点（G1F/G2F）为主，具体分布：
- **G0F/G0F**：占比约30%-40%，表明抗体Fc区存在四臂糖基化特征。
- **G1F/G2F**：占比约15%-20%，反映糖链复杂性的自然分布。
- **异常糖基化检测**：在USP 003中首次发现G2F/G2F构型（理论质量146,386 Da，实测146,389 Da，误差19 ppm），提示可能存在新型糖基化修饰。

#### （3）脱酰胺与唾液酸化修饰
- **脱酰胺**：主要发生在N-乙酰天冬氨酸（Asn）残基，实验检测到3%-7%的修饰率。在USP 001的酸性峰（迁移时间7.97分钟）中，脱酰胺修饰体占比达18.7%，显著高于其他mAb。
- **唾液酸化**：所有样品均检测到糖链末端的9-O-岩藻糖基化（Neu5Ac），其中USP 002的酸性峰中Neu5Ac修饰占比达32%，可能影响抗体-靶点结合亲和力。

### 方法学优势验证
通过对比三种mAb的质谱数据与已发表的糖基化谱图（误差范围±35 ppm），验证了CZE-MS系统在以下方面的可靠性：
1. **低丰度修饰检测**：500皮克样品中，单剪切体（-Lys）和脱酰胺修饰体（误差±30 ppm）仍可被准确识别。
2. **电荷状态分离**：质谱在4,000-10,000 m/z范围内实现基线分离，对双电荷状态（如+2、+3）的分辨率达1.5。
3. **重现性保障**：三次独立实验的迁移时间标准差（RSD）控制在3%以内，峰面积相对标准差（RSD）<5%。

### 工业应用前景与挑战
该技术为生物制药质量保证提供了新范式：
- **监管合规性**：符合ICH Q6B对电荷变异体（CV）分析的指导原则，支持mAbs的I-IV期临床样本分析。
- **成本效益比**：单次分析成本低于传统LC-MS联用技术（约节省60%），且分析时间缩短80%以上。
- **扩展性探索**：研究团队已初步验证该技术对双特异性抗体（分子量>1 MDa）和ADCs（抗体-药物偶联物）的分析可行性，但对核酸类疗法的适配仍需解决高负电荷导致的盐加成干扰问题。

### 总结
本研究通过整合微流控电泳的分离优势与高分辨质谱的鉴定能力，建立了mAbs PTMs分析的标准化流程。实验证实，CZE-MS系统可在12分钟内完成500皮克级样品的全电荷状态分析，检测灵敏度较传统方法提升3个数量级。该技术不仅有效监控了关键质量属性（CQAs）如糖基化模式、剪切程度和脱酰胺水平，更为后续开发适用于核酸药物、大分子复合物的分析技术奠定了基础。未来需进一步优化盐效应抑制策略，并建立多组学数据联动的分析平台，以满足生物制药日益复杂的监管需求。