糖酵解酶PFKFB3通过调控DNA损伤与NF-κB通路延缓骨关节炎软骨细胞衰老的新机制

《Cell Death Discovery》：The glycolytic enzyme PFKFB3 alleviates DNA damage and chondrocyte senescence in osteoarthritis

本研究针对骨关节炎（OA）中软骨细胞衰老的核心问题，探讨了糖酵解酶PFKFB3在调控DNA损伤修复与细胞衰老中的作用。研究人员通过体内外实验发现，PFKFB3表达下调会激活NF-κB信号通路、加剧DNA损伤并促进衰老相关分泌表型（SASP）产生，而PFKFB3过表达可显著缓解OA病理进程。该研究揭示了PFKFB3作为OA治疗新靶点的潜力，为代谢干预软骨衰老提供了理论依据。

　　

随着人口老龄化加剧，骨关节炎（Osteoarthritis, OA）已成为困扰全球数亿患者的常见退行性关节疾病。其特征性病理改变包括关节软骨进行性磨损、软骨下骨硬化以及滑膜炎症，最终导致关节疼痛和功能障碍。尽管OA发病机制复杂，近年来越来越多的证据表明，软骨细胞衰老在OA进展中扮演着关键角色。衰老的软骨细胞不仅功能退化，还会分泌大量炎症因子和基质降解酶，形成所谓的衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP），进而破坏关节内环境稳态。然而，调控软骨细胞衰老的具体分子机制尚未完全阐明，这成为阻碍OA治疗发展的瓶颈。

在细胞代谢层面，软骨细胞作为关节内唯一存在的细胞类型，其能量供应主要依赖于糖酵解而非氧化磷酸化。这种独特的代谢特征与关节腔内的低氧环境相适应，但也使得软骨细胞对糖酵解调控异常尤为敏感。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB）家族是糖酵解过程中的关键调控酶，其中PFKFB3亚型因其最高的激酶/磷酸酶活性比，被认为是维持高糖酵解速率的重要分子。有趣的是，近年研究发现PFKFB3不仅参与能量代谢调控，还能转位至细胞核内参与DNA损伤修复过程。那么，PFKFB3是否能够通过整合代谢重编程与DNA损伤应答，进而影响OA软骨细胞衰老进程？这一科学问题引起了研究人员的浓厚兴趣。

发表在《Cell Death Discovery》的这项研究首次系统揭示了PFKFB3在OA软骨细胞衰老中的保护作用及分子机制。研究人员通过分析临床样本和动物模型发现，PFKFB3在OA软骨组织中表达显著下调，且其表达水平与DNA损伤修复能力呈正相关。通过基因干预手段，他们证实PFKFB3缺失会加剧DNA损伤和细胞衰老，而PFKFB3过表达则能有效缓解这些病理变化。更为重要的是，研究揭示了NF-κB信号通路在PFKFB3调控网络中的关键介导作用，为理解代谢酶的多功能性提供了新视角。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用临床OA患者软骨样本（n=12）和手术诱导（DMM）及自然衰老的小鼠OA模型进行组织学分析；通过RNA干扰和腺相关病毒（AAV）介导的基因操作在体外原代软骨细胞和体内关节中进行PFKFB3功能研究；采用SA-β-Gal染色、彗星实验和免疫荧光等技术评估细胞衰老和DNA损伤程度；通过RNA测序和GSEA分析探索相关信号通路；使用NF-κB抑制剂进行药理学验证。

PFKFB3表达在骨关节炎软骨中降低

研究人员首先通过生物信息学分析发现，PFKFB3是软骨组织中PFKFB家族的主要表达亚型。在临床OA患者软骨样本中，PFKFB3蛋白表达显著降低，同时伴随II型胶原（COL2A1）减少和基质金属蛋白酶13（MMP13）增加，表明PFKFB3下调与软骨降解密切相关。在DMM手术诱导和自然衰老两种OA小鼠模型中，研究人员同样观察到PFKFB3表达明显下降，且与软骨破坏程度呈负相关。这些结果一致表明PFKFB3表达减少是OA的共性特征。

PFKFB3调控软骨细胞DNA损伤和衰老

为了探究PFKFB3的功能，研究人员在原代软骨细胞中分别进行PFKFB3敲低和过表达操作。RNA测序和基因集富集分析（GSEA）显示，DNA损伤应答和细胞衰老相关通路在PFKFB3干预组中显著富集。进一步实验发现，OA软骨中DNA损伤标志物γH2AX和TUNEL信号增强，而DNA修复关键蛋白p-ATM和p-ATR表达降低。值得注意的是，PFKFB3敲低会进一步抑制p-ATM和p-ATR的磷酸化水平，提示PFKFB3参与调控DNA损伤修复过程。

PFKFB3缓解DNA损伤和软骨细胞衰老

在过氧化氢（H₂O₂）诱导的衰老模型中，PFKFB3敲低会加剧细胞衰老、凋亡和DNA损伤，表现为SA-β-Gal阳性率升高、TUNEL信号增强以及γH2AX焦点形成增加。相反，PFKFB3过表达则能显著抑制H₂O₂诱导的上述病理变化。在分子水平上，PFKFB3敲低上调了p16^INK4a、p21等衰老标志物以及白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等SASP因子的表达，而PFKFB3过表达则呈现相反效应。此外，在电离辐射和依托泊苷诱导的DNA损伤模型中，PFKFB3同样表现出保护作用，证实其在多种应激条件下均能维持基因组稳定性。

NF-κB通路参与PFKFB3介导的衰老调控

机制探讨方面，GSEA分析提示NF-κB信号通路可能参与PFKFB3的调控网络。实验证实PFKFB3敲低会增加NF-κB关键亚基p65的磷酸化水平，而不影响总p65蛋白表达。使用pristimerin和IT901两种NF-κB抑制剂处理后，PFKFB3敲低引起的细胞衰老和SASP因子表达上调得到显著缓解。值得注意的是，研究人员未检测到PFKFB3与NF-κB通路蛋白之间的直接相互作用，且PFKFB3主要定位于细胞质而非细胞核，表明其可能通过间接方式调控NF-κB活性。

PFKFB3在体内缓解创伤后骨关节炎

最后，研究人员通过关节腔内注射AAV-PFKFB3病毒验证其治疗潜力。结果显示，PFKFB3过表达能显著改善DMM小鼠的软骨破坏，降低OARSI评分，减少TUNEL阳性细胞数，并提高p-ATM、p-ATR和COL2A1的表达水平。相反，AAV介导的PFKFB3敲低则加剧了软骨退化。这些体内实验数据有力支持了PFKFB3在OA中的保护作用。

本研究系统阐明了PFKFB3通过调控DNA损伤修复和NF-κB信号通路抑制软骨细胞衰老的新机制。在生理条件下，PFKFB3通过维持DNA修复能力和抑制NF-κB过度激活来保障软骨稳态；而在OA病理状态下，PFKFB3表达下调导致DNA损伤积累、炎症反应加剧和细胞衰老加速，最终促进OA进展。这一发现不仅深化了对OA发病机制的理解，还为开发靶向PFKFB3的OA治疗策略提供了理论依据。尽管研究存在临床样本年龄不匹配、AAV载体局限性等问题，但其所揭示的代谢-衰老轴调控机制为OA研究开辟了新方向。未来基于PFKFB3的基因治疗或小分子调控策略可能为OA患者带来新的希望。