新型阳离子Gemini表面活性剂的结构依赖性抗酵母效应：从膜脂质组学到线粒体功能调控

《Scientific Reports》：The structure-dependent effects of newly synthesised cationic gemini surfactants against yeast cells

本研究针对微生物耐药性日益严峻的现状，系统探究了新型阳离子Gemini季铵盐(QAS)的结构依赖性抗真菌机制。研究人员通过合成不同烷基链长度(C12, C14)和抗衡离子(溴化物、盐酸盐、甲基碳酸盐)的Gemini QAS，发现其能显著增强酵母细胞膜通透性、改变膜脂质组成(如提升固醇含量)、抑制质膜与线粒体H+-ATPase活性、阻碍氨基酸摄取并诱发氧化应激。该研究为开发高效低毒的抗真菌剂提供了重要理论依据。

　　

在微生物耐药性日益成为全球公共卫生挑战的背景下，寻找新型高效抗菌剂显得尤为迫切。季铵盐类化合物因其独特的阳离子特性和两亲结构，能够有效破坏微生物细胞膜，已成为消毒剂研发的重要方向。其中，Gemini（双子）型季铵盐通过连接基将两个单链季铵盐分子连接，展现出更优的表面活性和抗菌性能。然而，其抗真菌作用机制，特别是结构差异（如烷基链长度、抗衡离子）对生物学效应的调控规律尚不明确。为此，Mazurkiewicz E.、Oblak E.等研究者在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果，深入揭示了新合成的阳离子Gemini表面活性剂对酿酒酵母细胞的结构依赖性效应。

为阐明其作用机制，研究团队综合运用了多种关键技术方法。研究以酿酒酵母Σ1278b为模型，主要技术包括：通过原子吸收光谱和DNA定量分析评估细胞膜完整性；利用气相色谱-质谱联用(GLC-MS)技术系统分析细胞膜的脂肪酸、固醇（如麦角固醇、酵母固醇、羊毛固醇）及磷脂的定性与定量变化；通过体外及体内实验检测质膜和线粒体H⁺-ATP酶活性；借助荧光光谱和显微镜技术评估氧化应激水平；使用氧电极测量细胞耗氧量以反映呼吸功能；并通过透射电子显微镜(TEM)观察细胞超微结构的改变。

1. Effect of gemini QAS on the integrity of the yeast S. cerevisiae cell membrane

研究表明，所有测试的Gemini QAS均能显著增加酵母细胞膜对钾离子(K⁺)的通透性，使泄漏量达到约70%，约为未处理对照组（约30%）的两倍。然而，除2xC12BrG3引起少量DNA泄漏（30%）外，其他化合物并未引起显著的DNA泄漏，提示这些表面活性剂主要增加膜通透性，而非立即导致膜完全破裂和细胞溶解。添加KCl可减弱QAS的抗菌活性，表明钾离子环境会影响其作用效果。

2. Effect of cationic gemini surfactants on the lipid composition of the yeast cell membrane

Gemini QAS显著改变了酵母细胞膜的脂质组成。总脂肪酸含量增加，其中2xC12BrG3和2xC12MeCO3G3提高了不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例（分别增至2.21和2.35），暗示膜流动性可能增强；而含C14长链的化合物（2xC14BrG3, 2xC14HClG3）则降低了该比例（分别降至1.01和1.16），表明膜刚性可能增加。尤为重要的是，所有化合物均促进了固醇合成，特别是2xC14BrG3和2xC14HClG3使麦角固醇含量分别增加了2.25倍和5.10倍，同时其前体（酵母固醇、羊毛固醇）也显著积累。磷脂组成相对稳定，但2xC12HClG3处理下磷脂酰丝氨酸(PS)未被检测到。

3. In vivo and in vitro activity of H+-ATPase of yeast S. cerevisiae

Gemini QAS在体内和体外实验中均显示出对质膜和线粒体H⁺-ATP酶的抑制作用。体内实验表明，QAS处理降低了环境酸化速率，即抑制了质膜H⁺-ATP酶的质子泵功能。体外抑制实验显示，多数化合物对质膜H⁺-ATP酶的半数抑制浓度(IC₅₀)低于其最小抑制浓度(MIC)，而对线粒体H⁺-ATP酶，2xC12BrG3和2xC14HClG3的IC₅₀低于MIC，其他化合物则高于MIC。这表明抑制这些关键酶是QAS作用的重要机制之一。

4. Uptake of amino acids by yeast cells

Gemini QAS显著抑制了酵母细胞在Gap1通透酶抑制条件和去抑制条件下对苯丙氨酸的摄取。在抑制条件下，摄取被抑制了约40-50%；在去抑制条件下，抑制程度更为显著，达到70-80%。这可能是由于膜电位破坏（与K⁺泄漏和H⁺-ATP酶抑制相关）以及能量（ATP）供应受阻共同导致。

5. Oxidative stress

所有测试的Gemini QAS均能诱导酵母细胞内活性氧(ROS)水平显著升高，引发氧化应激。其中，2xC12MeCO3G3（甲基碳酸盐）的作用最强，使荧光强度增加约2.5倍；溴化物（C12, C14）也使氧化应激水平增加约2倍；盐酸盐的作用相对较弱，增加约50-90%。荧光显微镜观察直观地证实了这一结果。

6. Yeast cells' oxygen consumption in the presence of cationic gemini surfactants

Gemini QAS完全抑制了酵母细胞在葡萄糖存在下的耗氧过程，效果与呼吸链抑制剂叠氮化钠相似。这表明QAS严重干扰了细胞的呼吸作用和能量代谢。补充KCl可以部分恢复耗氧，进一步印证了钾离子稳态在维持正常细胞功能（包括呼吸）中的重要性。

7. Yeast cell morphology

透射电镜观察显示，经Gemini QAS处理的酵母细胞出现了细胞壁增厚（如2xC12BrG3）、出现众多小液泡和脂滴（如2xC14BrG3和2xC14HClG3）等形态学改变，反映了细胞在应激下的适应性反应或损伤。

本研究系统阐明了新型阳离子Gemini表面活性剂通过多靶点作用机制抑制酿酒酵母生长的过程。其作用始于与细胞膜的相互作用，导致膜通透性增加和离子稳态失衡。进而，QAS深刻影响膜脂质组成，特别是显著提升固醇含量，这可能改变膜物理性质并影响膜蛋白功能。对质膜和线粒体H⁺-ATP酶活性的抑制，直接破坏了细胞的质子梯度和能量（ATP）合成。能量代谢的抑制（耗氧停止）和膜电位的破坏共同导致了营养物质（如氨基酸）摄取的严重受阻。最终，线粒体功能受损可能触发了细胞内氧化应激的急剧升高，对生物大分子造成损伤，并诱导细胞凋亡。研究明确揭示了化合物结构（尤其是烷基链长度）与活性的关系：含有12碳短链的Gemini QAS通常表现出比14碳长链同类物更强的生物活性，这可能源于短链分子更容易插入和扰动细胞膜。该研究不仅深化了对Gemini QAS抗真菌机制的理解，揭示了其多靶点、多层次的复杂作用方式，而且为基于结构优化设计新一代高效、选择性抗真菌剂提供了重要的理论依据和实验支撑。