铜绿假单胞菌ATP合酶的独特结构特征及其抗菌靶点潜力

《Nature Communications》：Distinct structural features of Pseudomonas aeruginosa ATP synthase revealed by cryo-electron microscopy

本研究针对开发新型抗菌药物的迫切需求，聚焦于机会性病原体铜绿假单胞菌的能量核心——F1FoATP合酶。研究人员通过高分辨率冷冻电镜技术，解析了该酶2.0-2.4 ?的三维结构，揭示了其区别于真核生物的独特特征：ε亚基的抑制性结合位点及胞质侧质子通道的金属离子帽。研究进一步通过功能实验证实这些特征调控ATP的合成与水解，明确了其作为新型抗菌靶点的潜力，为应对细菌耐药性提供了新思路。

　　

在微生物与人类永无休止的军备竞赛中，抗生素的发现曾是人类的辉煌胜利，然而细菌耐药性的出现和蔓延使得这场胜利变得短暂。多重耐药菌的泛滥，特别是像铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）这样的机会性病原体，对全球公共卫生构成了严峻威胁。这种细菌是医院内感染的主要元凶之一，能引起肺炎、血流感染等严重疾病，且对多种常用抗生素具有天然或获得性耐药性。因此，开发针对全新靶点、不易产生耐药性的抗菌药物已成为当务之急。

生物体的能量货币是三磷酸腺苷（ATP），而负责合成ATP的关键分子机器是F₁F_oATP合酶（ATP synthase）。这个酶广泛存在于细菌、线粒体和叶绿体中，通过利用质子（或钠离子）跨膜流动产生的驱动力（质子驱动力，proton-motive force）来驱动其内部结构的旋转，从而催化ATP的合成。有趣的是，虽然ATP合酶的核心功能和基本结构在进化上非常保守，但其在细菌和人类（真核生物）版本之间存在着细微却至关重要的结构差异。这些差异就像一把“分子锁”，使得针对细菌ATP合酶设计药物时，有可能只破坏细菌的能量工厂，而不影响人类细胞自身的功能，从而实现选择性杀伤。然而，要充分挖掘这一靶点的潜力，首先需要在原子水平上清晰地“看见”细菌ATP合酶，特别是病原菌ATP合酶的精确三维结构，识别出那些真正独特且关键的靶点。

为此，研究人员将目光投向了铜绿假单胞菌的ATP合酶。本研究旨在利用冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）这一强大的结构解析工具，以高分辨率揭示该酶的结构奥秘，以期发现可用于新型抗菌药物开发的独特结构特征。相关研究成果发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：通过冷冻电镜技术解析了铜绿假单胞菌ATP合酶在静息状态及与底物MgATP孵育后的高分辨率结构；利用生化功能分析评估了ε亚基和金属结合位点修饰对ATP合成与水解活性的影响；采用质谱分析鉴定了结合在ATP合酶上的生理性金属离子的身份；并通过聚焦分类方法分析了F_o马达中c环的旋转亚步进运动。

结构整体解析与独特特征

研究人员成功解析了铜绿假单胞菌F₁F_oATP合酶分辨率在2.0至2.4 ?之间的冷冻电镜结构。这些高分辨率结构如同一份精确的分子蓝图，使研究人员能够清晰地观察到每个氨基酸残基和辅基的精确位置。分析结果显示，该酶的整体架构与其他物种的ATP合酶相似，由一个用于ATP合成/水解的球状F₁头部和一个嵌于膜中、负责质子转运的F_o马达组成。然而，研究团队敏锐地识别出了两个此前未在其他同源物中报道的、属于铜绿假单胞菌的独特结构特征。第一个特征是抑制性ε亚基的构象和结合方式与已知结构不同，占据了独特的空间位置。第二个特征是在F_o部分的胞质侧（细胞质一侧）质子通道入口处，发现了一个由氨基酸侧链配位结合的金属离子，像一个“帽子”一样覆盖在通道口。

ε亚构象变化与酶活性调控

为了探究ε亚基的功能，研究人员获得了ATP合酶与底物MgATP孵育后的较低分辨率三维结构。对比静息状态的结构，他们观察到ε亚基发生了明显的构象重排。这一结构变化与酶的激活过程相关联，表明ε亚基在铜绿假单胞菌ATP合酶的活性调控中扮演着动态开关的角色，其构象变化直接影响了酶的催化功能。

胞质侧质子通道与金属离子帽

对F_o区域的高分辨率结构进行细致分析，研究人员确认了胞质侧质子通道顶端的金属离子结合位点。该位点由高度保守的氨基酸残基组成，能够稳定地结合一个二价金属离子。功能分析实验表明，通过突变破坏这个金属结合位点，会显著影响ATP的合成和水解活性。这证明了这个“金属离子帽”并非偶然存在，而是质子转运过程的一个关键功能元件，对维持通道的正常功能至关重要。

周质侧质子半通道与Grotthuss质子传递

在膜的另一侧，即周质侧（细菌细胞膜与外膜之间的空间），研究人员在F_o的质子半通道中可视化了一系列有序的水分子。这些水分子与通道内壁的极性氨基酸残基形成了氢键网络。这一结构特征直接支持了质子跨膜转运的Grotthuss机制，即质子并非以裸离子形式扩散，而是通过氢键网络的重排，以“跳跃”的方式快速传递。

c环旋转亚步进与质子化事件

ATP合酶的工作核心是F_o马达中c环的旋转。研究人员对c环颗粒进行了聚焦分类和精细的结构分析，成功分辨出c环旋转周期中约为11°的离散亚步进。这些亚步进被认为对应于单个c亚基在周质侧结合质子（质子化，protonation）和在胞质侧释放质子（去质子化，deprotonation）的分子事件，从而在原子水平上揭示了旋转催化与质子转运耦合的精细过程。

生理金属离子的鉴定

那么，结合在关键位点的生理性金属离子究竟是哪种离子？为了回答这个问题，研究人员利用质谱分析法对纯化的ATP合酶样品进行了元素分析。分析结果强烈表明，在生理条件下占据该结合位点的金属是锌离子（Zn²⁺），而非镁离子（Mg²⁺）或钙离子（Ca²⁺）等其他二价金属离子。这一发现为理解该位点的具体化学性质和设计靶向药物提供了重要的化学基础。

综上所述，本研究通过高分辨率冷冻电镜结构解析与功能验证，系统地揭示了铜绿假单胞菌ATP合酶的多个独特结构特征。这些特征包括ε亚基独特的抑制性结合位点及其在激活过程中的构象变化，以及位于胞质侧质子通道入口、对酶功能有关键影响的锌离子结合位点。研究还从结构上支持了周质侧的Grotthuss型质子传递机制，并解析了c环旋转的质子化/去质子化亚步进。这些发现不仅深化了对ATP合酶这一基础生命过程核心酶的工作原理的理解，更重要的是，明确指出了铜绿假单胞菌ATP合酶上可作为抗菌药物开发靶点的特异性结构域。由于这些特征在人类同源物中不存在或存在显著差异，针对它们设计抑制剂有望实现对铜绿假单胞菌的高度选择性抑制，为应对日益严峻的耐药菌感染问题提供了新的战略方向和坚实的结构基础。