基于片段筛选技术直接靶向黑色素瘤癌基因MITF的突破性发现

《Nature Communications》：Fragment-based discovery enables direct targeting of the melanoma oncogene MITF

本研究针对晚期黑色素瘤治疗耐药性难题，通过片段筛选和结构优化策略，首次实现了对转录因子MITF（小眼畸形相关转录因子）DNA结合域的直接靶向。研究人员利用19F-NMR筛选技术发现苗头化合物，通过X射线晶体学和分子动力学模拟指导优化，获得对MITF具有亚微摩尔级亲和力且对MYC/MAX家族具有>100倍选择性的小分子抑制剂。该工作为直接靶向bHLH-LZ转录因子家族提供了概念验证，为开发新型黑色素瘤疗法奠定基础。

　　

在恶性黑色素瘤治疗领域，尽管BRAF/MEK抑制剂和免疫检查点抑制剂的应用取得了显著进展，但肿瘤异质性和耐药性仍是导致治疗失败的主要原因。其中，小眼畸形相关转录因子（MITF）作为黑色素细胞谱系存活癌基因，在黑色素瘤发生发展和治疗抵抗中扮演关键角色。然而，作为碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）转录因子家族成员，MITF因其缺乏传统药物结合口袋，长期以来被视为"不可成药"靶点。

为了破解这一难题，Novartis生物医学研究所的Deborah Castelletti、Jürgen Hinrichs、Goran Malojcic等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过创新性的药物发现策略，首次实现了对MITF转录因子的直接靶向，为晚期黑色素瘤患者提供了新的治疗希望。

研究团队主要运用了片段筛选核磁共振（¹⁹F-NMR）技术、X射线晶体学、等温滴定量热法（ITC）、表面等离子共振（SPR）、分子动力学（MD）模拟、基因编辑与功能验证（包括RNA测序、Cut&Tag染色质分析等）以及基于COMBI-i临床试验队列的生物信息学分析等关键技术方法。

临床数据揭示MITF靶向治疗必要性

通过对COMBI-i三期临床试验数据的回顾性分析，研究人员发现无论患者对靶向治疗（达拉非尼/曲美替尼）单独或联合免疫治疗（斯巴达利珠单抗）的反应如何，肿瘤细胞中MITF表达水平均显著高于正常组织。单细胞RNA测序数据进一步证实，治疗前后肿瘤内始终存在MITF高表达的细胞亚群，这为MITF靶向治疗提供了临床依据。

MITF驱动耐药黑色素瘤细胞存活

研究人员在多种黑色素瘤模型（包括BRAF突变和NRAS突变细胞系）中证实，即使细胞对MAPK抑制剂产生获得性耐药，其存活仍高度依赖MITF。RNA测序分析显示，耐药细胞虽然整体MITF转录特征有所下降，但仍保留足够的MITF活性来驱动细胞增殖，且MITF敲低可同样有效抑制敏感和耐药细胞的生长。

片段筛选发现MITF配体

研究团队利用包含约4000个片段的LEF4000库，通过¹⁹F-NMR筛选MITF的bHLH-LZ DNA结合域（180-296），获得了11个初筛命中片段，其中9个通过蛋白观测NMR验证。这些片段结合亲和力较弱（K_D>1 mM），但为后续优化提供了重要起点。

晶体结构揭示结合模式

MITF（217-296）与化合物3和4的共晶结构（分辨率分别为1.09 ?和1.94 ?）显示，这些片段结合于MITF特有的"扭结口袋"（kink pocket）。该口袋由MITF特有的三氨基酸插入（E260-Q261-Q262）形成，是区别于其他bHLH-LZ家族成员的关键结构特征。

片段合并优化配体亲和力

通过叠加化合物3和4的晶体结构，研究人员采用片段合并策略设计出化合物6，其结合亲和力（K_i= 2.6 μM）比先导化合物提高了100多倍。进一步结构优化得到化合物8和9，其ITC测得的K_D值分别为0.47±0.17 μM和0.39±0.20 μM，且对MYC/MAX具有至少100倍的选择性。

配体结合调控MITF同源二聚体动态

NMR和分子动力学模拟研究表明，MITF同源二聚体中扭结螺旋和直螺旋之间存在快速构象交换（纳秒级）。小分子配体（特别是化合物7）的结合可显著减缓这种动态交换过程，提示配体可能通过调控蛋白动态影响其功能。

靶向扭结口袋实现功能性MITF抑制

为探究扭结口袋的功能意义，研究人员构建了Q261A、R263A和A264C等点突变体。功能实验表明，这些突变（特别是A264C）虽不影响MITF的DNA结合能力，但显著削弱其挽救MITF依赖性细胞表型的能力。Cut&Tag和RNA测序整合分析发现，A264C突变体虽能结合染色质，但无法完全恢复MITF依赖性转录程序，提示扭结区域在MITF功能中具有重要作用。

本研究通过多学科交叉方法，首次证明了直接靶向MITF转录因子的可行性。研究发现不仅为开发新型黑色素瘤治疗策略奠定了基础，也为靶向传统认为"不可成药"的bHLH-LZ转录因子家族提供了概念验证和实践范例。更重要的是，研究揭示的蛋白动态调控机制为理解转录因子功能调控提供了新视角。随着更具细胞活性的MITF抑制剂的开发，未来有望为晚期黑色素瘤患者提供新的治疗选择，同时为相关转录因子靶向药物开发提供宝贵蓝图。