超大规模虚拟筛选发现神经调节孤儿受体GPR139的高效激动剂及其机制研究

《Nature Communications》：Ultra-large virtual screening unveils potent agonists of the neuromodulatory orphan receptor GPR139

本研究针对孤儿GPCR GPR139缺乏高效特异性工具化合物的难题，通过将2.35亿个化合物对接到GPR139的冷冻电镜结构进行超大规模虚拟筛选，发现了具有纳摩尔级效价的新型激动剂，并利用结构生物学手段验证了其结合模式。该研究不仅揭示了GPR139偶联G12蛋白的新功能，还证实了激动剂在动物模型中具有调节运动行为和焦虑样行为的作用，为神经精神疾病的药物开发提供了重要候选化合物和理论基础。

　　

在大脑的复杂网络中，G蛋白偶联受体（GPCR）如同精密的信息中转站，调控着我们的情绪、认知和行为。然而，其中超过100个非嗅觉GPCR仍然是被称为"孤儿"的神秘存在——它们的天然配体和生理功能尚未明确。GPR139就是这样一个引人入胜的谜题，这个高度保守的受体特异性地表达于中枢神经系统的缰核等区域，这些区域与精神分裂症、抑郁症等神经精神疾病密切相关。尽管基因研究表明GPR139位点与精神分裂症和注意力缺陷多动障碍（ADHD）存在关联，且GPR139敲除小鼠会表现出类似精神分裂症的症状，但针对该受体的药物研发却因缺乏高效、特异的工具化合物而进展缓慢。

传统的药物发现方法在GPR139这类孤儿受体面前往往显得力不从心。高通量筛选成功率低，且已知的GPR139配体如芳香族氨基酸和某些肽类，其激活效力较弱，难以作为理想的探针分子。更令人遗憾的是，尽管制药公司武田开发的TAK-041已进入临床二期试验，用于治疗精神分裂症患者的快感缺失，却因疗效不足未能达到主要终点。这一挫折并未减弱科学界对GPR139的兴趣，反而凸显了开发新型GPR139调节剂的迫切性。

转机出现在GPR139高分辨率结构的确立。2022年，研究人员解析了GPR139与合成激动剂JNJ-63533054结合的冷冻电镜结构，首次揭示了该受体配体结合口袋的精细特征。这一突破性进展为《自然·通讯》最新发表的研究提供了关键基础，使研究人员能够采用结构导向的虚拟筛选策略，从海量化学空间中寻找GPR139的新型配体。

为了验证结构信息在配体发现中的价值，国际研究团队开展了一项规模空前的计算筛选工作。他们将包含2.35亿个类先导化合物的ZINC15库对接到GPR139的结合位点，使用DOCK3.7软件评估了超过200万亿个复合物构象，相当于单核CPU连续运行6年的计算量。从排名前0.12%的分子中，研究人员通过聚类分析和视觉检查，最终选出68个最具潜力的化合物进行实验验证。

研究团队主要运用了以下几项关键技术：基于冷冻电镜结构的分子对接技术用于初筛；钙流检测和IP1积累测定用于评估G_q/₁₁信号通路激活；BRET技术用于分析G蛋白激活和Arrestin-3招募；冷冻电镜用于解析受体-配体复合物结构；AlphaFold3用于评估人工智能预测蛋白-配体复合物的能力；以及小鼠旷场实验用于验证化合物的体内行为学效应。

虚拟筛选发现五类新型GPR139激动剂

在功能筛选中，14个化合物在10μM浓度下显示出激动剂活性，其中5个化合物（1-5）表现出完整的浓度-效应关系，EC₅₀值介于160 nM至3.6μM之间。这些化合物均能特异性激活GPR139，而不作用于作为对照的M1毒蕈碱受体。在更为直接的IP1积累实验中，这些化合物的活性趋势与钙流实验结果一致，尽管效力略低，这可能反映了钙信号检测的放大效应。

尤为值得注意的是，这些新发现的激动剂在化学结构上呈现出丰富的多样性。与ChEMBL数据库中已知的GPR139配体相比，化合物2-4的拓扑相似度极低（Tc < 0.30），尤其是化合物1的核心骨架在包含约250万个化合物的ChEMBL数据库中竟然没有相关的生物活性报道，表明这是一个全新的药物发现 scaffold。分子对接预测显示，这些化合物能够模拟参考激动剂JNJ-63533054的关键相互作用，如通过酰胺或尿素基团与E108^3×32和R244^6×51形成氢键，同时又能与W166^ECL2等残基建立独特的相互作用网络。

结构导向的激动剂优化

基于化合物1（EC₅₀= 160 nM）的优异表现，研究人员将其作为先导化合物进行结构优化。通过两轮基于结构的药物设计，他们从数十亿个商业化合物中筛选出7574个类似物，并最终合成了44个衍生物进行实验评估。

结构-活性关系（SAR）分析揭示了该 scaffold 的构效规律：噻吩环上的甲基取代并非活性必需，但4位甲基能够将效力提高3倍（化合物1.1，EC₅₀= 50 nM）；较大的取代基通常会降低活性；将噻吩替换为呋喃影响不大，但替换为极性更强的噻唑或噁唑则会显著降低效力；苯环取代通常能够保持活性，且甲基取代优于甲氧基取代；中心的1,2,4-噁二唑环是维持活性的关键结构，将其替换为三唑或噁唑会导致活性大幅下降。

最优化的化合物1.1在钙流和IP1积累实验中均表现出50 nM的EC₅₀值，其效力与临床候选化合物TAK-041相当，甚至优于JNJ-63533054和Lundbeck Cmp 1a等参考激动剂，成为目前已知最有效的GPR139激动剂之一。

冷冻电镜结构验证预测结合模式

为了确认计算预测的准确性，研究人员解析了GPR139与化合物1.1结合的冷冻电镜结构（分辨率3.2 ?，PDB：9M42）。实验结果表明，S-构型的1.1(S)与受体的结合模式与对接预测高度一致（配体RMSD = 2.9 ?），成功再现了苯乙酰胺和1,2,4-噁二唑部分的结合方位。

与JNJ-63533054结合的结构相比，化合物1.1(S)诱导了结合口袋胞外区域的轻微扩张。结合模式分析显示，1.1(S)的苯乙酰胺部分更偏向胞外侧，其酰胺羰基同时与R244^6×51和W166^ECL2形成极性相互作用，而JNJ-63533054的相应基团仅与R244^6×51作用。此外，1.1(S)的1,2,4-噁二唑环取代了JNJ-63533054中的第二个酰胺基团，导致该部分向TM6方向移动，而噻吩基团则伸入由TM6和TM7形成的、未被JNJ-63533054占据的子口袋中。

AlphaFold3在孤儿GPCR配体预测中的局限性

研究人员还评估了深度学习工具AlphaFold3（AF3）在预测孤儿GPCR-配体复合物方面的能力。虽然AF3能够较准确地预测GPR139与1.1(S)的结合模式（配体RMSD = 2.7 ?），但这可能得益于其训练集中包含了GPR139的结构。当测试五个训练集中未包含的孤儿GPCR复合物时，AF3仅在一个案例中取得了合理精度，而在其余四个案例中要么预测误差较大，要么将配体放置在正交位点之外，这表明AF3对于未充分研究的受体-配体相互预测能力有限，尚不能替代实验结构确定在虚拟筛选中的应用。

新型激动剂的信号特征

研究人员对优化后的化合物1.1及其对映体进行了全面的信号通路表征。结果表明，1.1(S)和JNJ(S)均能激活G_i2、G_i3、G_oA、G_q和G₁₂蛋白，并招募Arrestin-3。其中，1.1(S)对G₁₂蛋白的激活尤为显著，这是GPR139信号转导的一个新发现。

立体化学分析显示，S-构型对映体的活性显著优于R-构型，1.1(S)比1.1(R)强13-63倍，而JNJ(S)比JNJ(R)强40-158倍。在稳定表达GPR139的CHO-K1细胞系中，1.1(S)的EC₅₀值达到8 nM，进一步证实了其高效性。这些发现不仅提供了GPR139信号偏倚性的详细信息，也为未来开发具有特定信号特征的GPR139调节剂奠定了基础。

体内行为学效应验证

为了评估这些激动剂的治疗潜力，研究人员选择了代谢稳定性更优的化合物1.5(S)进行小鼠旷场实验。结果显示，30 mg/kg腹腔注射后，1.5(S)和JNJ-63533054均能显著减少小鼠的活动总距离，并增加其在周边区域的活动时间（趋触性），表明这些化合物能够穿透血脑屏障并影响运动行为和焦虑样行为。

药代动力学分析证实，给药一小时后，1.5(S)和JNJ-63533054在脑组织中的浓度均超过其体外效力值，表明这些化合物具有良好的脑部暴露量。这一发现为GPR139作为神经精神疾病治疗靶点的可行性提供了直接证据。

研究结论与意义

这项研究通过整合计算与实验方法，在孤儿受体GPR139的药物发现领域取得了三项重要突破。首先，超大规模虚拟筛选成功识别出多个高效GPR139激动剂，其化学结构多样且具有新颖性，为探针开发和药物优化提供了优质起点。其次，结构导向的优化产生了目前已知最有效的GPR139激动剂之一，冷冻电镜结构验证了计算预测的准确性，建立了从计算到实验的闭环研究范式。最后，全面的信号表征揭示了GPR139偶联G₁₂蛋白的新功能，而体内实验则证实了这些激动剂的行为学效应，为理解GPR139的生理功能和治疗潜力提供了宝贵见解。

这项研究展示了结构生物学与大规模计算筛选相结合在孤儿GPCR药物发现中的强大潜力。尽管深度学习工具如AlphaFold3在预测已知受体-配体复合物方面表现出色，但对于未充分研究的靶点，实验结构确定仍然是虚拟筛选成功的关键。GPR139激动剂的发现不仅为研究这个神秘受体的生物学功能提供了重要工具，也为开发神经精神疾病的新疗法开辟了道路。随着对GPR139信号网络和生理功能的深入探索，这一高度保守的孤儿受体有望成为未来神经精神药物开发的重要靶点。