CDK1/WEE1信号回路通过RPA磷酸化编码调控G2/M期转换及DNA损伤应答的机制研究

《Nature Communications》：Mechanism of RPA phosphocode priming and tuning by CDK1/WEE1 signaling circuit

本研究揭示了复制蛋白A（RPA）在细胞周期调控中的新机制。研究人员发现CDK1激酶对RPA70亚基Thr-191位点的磷酸化修饰，与RPA32亚基Ser-23/Ser-29位点共同构成"磷酸化编码"，通过构象重排促进RPA32超磷酸化，同时通过稳定Wee1激酶形成反馈回路调控G2/M期转换。该发现阐明了RPA在不同DNA代谢过程中的双向调控功能，为理解细胞周期检查点协调机制提供了新视角。

　　

在细胞生命活动中，DNA的复制、修复和重组等代谢过程需要精密调控，其中复制蛋白A（Replication Protein A, RPA）作为重要的单链DNA（ssDNA）结合蛋白，发挥着核心作用。RPA是由RPA70、RPA32和RPA14三个亚基组成的异源三聚体，其通过多个寡核苷酸/寡糖结合（OB）结构域与DNA相互作用。长期以来，研究表明RPA32亚基的磷酸化修饰在DNA损伤应答中至关重要，特别是在其N端无序区域存在的多个磷酸化位点，如Ser-23和Ser-29等，这些位点被细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）磷酸化后，能够"启动"其他位点的超磷酸化，从而调控DNA修复过程。

然而，关于RPA在正常细胞周期进程中的功能，尤其是在G₂期向M期转换过程中的作用机制，以及RPA70亚基磷酸化的功能意义，仍然存在许多未知。此外，CDK1介导的磷酸化如何启动RPA32的超磷酸化，以及RPA与调控其磷酸化的激酶之间是否存在反馈调节机制，也是领域内亟待解决的科学问题。

为了回答这些问题，Poonam Roshan、Vikas Kaushik等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现RPA70亚基上的Thr-191位点是一个新的CDK1磷酸化位点，该位点与RPA32上的Ser-23和Ser-29位点共同构成一个"磷酸化编码"，不仅调控G₂/M期转换，还参与DNA损伤诱导的RPA32超磷酸化。这一发现揭示了RPA与细胞周期激酶之间的双向调控机制，为理解细胞如何协调正常细胞周期进程与DNA损伤应答提供了新的视角。

研究人员主要运用了基因编辑技术（CRISPR/Cas9）、蛋白质质谱分析、体外激酶实验、生物物理技术（圆二色谱、荧光各向异性、停流荧光、质谱光度法）和交联质谱（XL-MS）等多种方法，其中使用了人结直肠癌细胞系（HCT116）作为研究模型。

T191在RPA70上被CDK1磷酸化

通过免疫沉淀结合质谱分析，研究人员从有丝分裂细胞中鉴定出RPA70亚基上的Thr-191是一个新的磷酸化位点。该位点位于RPA70的DNA结合结构域A（DBD-A）中，且包含CDK1/细胞周期蛋白B激酶复合物识别的典型SP/TP基序。体外激酶实验证实，CDK1/细胞周期蛋白B能够在T191位点磷酸化RPA70，而CDK2/细胞周期蛋白A则不能。这些结果表明T191是CDK1特异性的磷酸化位点。

RPA70-T191磷酸化的缺失延迟G2向M期转换

为了研究T191磷酸化的生理功能，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了RPA70-T191A磷酸化缺陷型HCT116细胞系。与野生型（WT）细胞相比，T191A突变体细胞生长速度显著减慢，但未引起细胞死亡或基因组应激。进一步分析发现，突变体细胞中有丝分裂细胞比例显著降低，表明G₂向M期转换存在延迟。

RPA70-T191磷酸化维持CDK1/Wee1活性

机制上，T191A突变导致CDK1抑制性位点Tyr-15的磷酸化水平增加两倍以上，同时Wee1激酶的总蛋白水平显著升高。Wee1是磷酸化CDK1-Tyr-15的主要激酶，其稳定性受到CDK1负反馈调控。这些结果表明，RPA70-T191磷酸化通过调节Wee1稳定性，影响CDK1活性，从而调控G₂/M期转换。同步化实验进一步证实，在G₂期晚期，突变体细胞中Wee1水平和CDK1-Tyr-15磷酸化显著增加，导致有丝分裂进入延迟。

RPA-T191磷酸化不影响有丝分裂进程

尽管T191A突变延迟了G₂/M期转换，但一旦细胞进入有丝分裂，其进程并未受到影响。nocodazole同步化实验显示，突变体细胞在有丝分裂期间的组蛋白H3-S10磷酸化、CDK1-Tyr-15去磷酸化以及Wee1降解等方面与野生型无差异，染色体分离和凝集也正常。这表明RPA70-T191磷酸化特异性调控G₂/M期转换，而不影响有丝分裂进程。

RPA-T191磷酸化对DNA损伤诱导的RPA32超磷酸化至关重要

除了细胞周期调控，研究人员还发现T191位点在DNA损伤应答中发挥关键作用。T191A突变体细胞对SN-38、etoposide和甲基甲磺酸（MMS）等DNA损伤剂更为敏感，且RPA32的超磷酸化（如S4/S8和S33位点）显著降低。这种超磷酸化缺陷在G₂期细胞中尤为明显。恢复实验表明，突变体细胞在DNA损伤后修复能力下降，细胞死亡增加。这些结果说明RPA70-T191磷酸化是DNA损伤诱导RPA32超磷酸化所必需的。

磷酸模拟突变T191D不改变RPA的结构或ssDNA结合特性

为了探讨T191磷酸化的结构效应，研究人员纯化了T191D磷酸模拟突变型RPA蛋白。圆二色谱、荧光各向异性和停流荧光等实验表明，T191D突变不影响RPA的二级结构、ssDNA结合亲和力及动力学。质谱光度法和尺寸排阻色谱显示，T191D突变不改变RPA在ssDNA上的组装方式。这些结果表明T191磷酸化不通过改变ssDNA结合特性发挥功能。

结构质谱揭示T191磷酸化引起RPA构象重排

交联质谱（XL-MS）分析显示，T191D突变导致RPA70亚基内及各亚基间的交联减少，特别是蛋白相互作用结构域（OB-F和wh）和RPA32 N端的可及性增加。这些结构变化表明T191磷酸化引起RPA构象"开放"，使关键功能区域更易接近。

CDK1特异性磷酸化编码驱动RPA进一步构象重排

研究人员进一步构建了T191D、S23D、S29D三重磷酸模拟突变体（RPA3D）。XL-MS分析显示，RPA3D中RPA32 N端的交联完全消失，表明该区域完全暴露。同时，RPA3D的色氨酸荧光特性与T191D单突变体不同，提示三重磷酸化诱导了独特的构象状态。这些结果表明，CDK1介导的多位点磷酸化协同调控RPA的构象重排。

CDK1磷酸化编码引起RPA-ssDNA复合物组装细微变化

虽然RPA3D的ssDNA结合特性未改变，但在长ssDNA底物上，RPA3D形成了更高密度的核蛋白复合物。这表明磷酸化编码通过调节RPA在ssDNA上的组装方式，可能影响其在DNA修复中的功能。

细胞周期特异性磷酸化编码启动DNA-PK介导的超磷酸化

体外激酶实验显示，RPA3D显著增强DNA-PK对RPA32 S4/S8位点的磷酸化效率，且这种促进作用不依赖ssDNA。T191D和S23D/S29D单突变体也增强磷酸化，但三重突变体的效应最强，表明这些位点协同启动RPA32超磷酸化。蛋白酶切实验进一步证实RPA3D构象更为开放。

本研究揭示了RPA在细胞周期调控和DNA损伤应答中的新功能。首先，发现RPA70-T191是CDK1的新型磷酸化位点，该位点与RPA32-S23/S29共同构成细胞周期特异性磷酸化编码。其次，阐明该磷酸化编码通过构象重排，增加RPA32 N端和蛋白相互作用结构域的可及性，从而促进DNA损伤激酶（如DNA-PK）对RPA32的超磷酸化。第三，揭示RPA与CDK1之间存在反馈调节回路：RPA70-T191磷酸化通过稳定Wee1激酶，调控CDK1活性，影响G₂/M期转换。

这些发现不仅阐明了RPA磷酸化在协调细胞周期进程与DNA损伤应答中的核心作用，还提出了RPA与激酶之间双向调控的新范式。该研究为理解细胞如何通过磷酸化编码精细调控DNA代谢功能提供了重要理论基础，对揭示相关疾病（如癌症）的发病机制具有潜在意义。