双胍功能化肽模拟物：攻克耐药性ESKAPE病原体与脑膜炎的新型抗菌策略

《Nature Communications》：Biguanide-functionalized peptide mimics effectively combat drug-resistant ESKAPE pathogens and meningitis

本研究针对ESKAPE病原体引发的脑膜炎面临抗菌素耐药性和血脑屏障穿透性差的双重挑战，开发了双胍功能化的宿主防御肽模拟物PBGProOx20。该聚合物通过双齿氢键与细菌膜磷脂酰甘油强效结合，对全部ESKAPE病原体表现出广谱抗菌活性，并能有效穿透血脑屏障，在多种小鼠感染模型中展现显著治疗效果，且不易诱导耐药性产生，为耐药性中枢神经系统感染提供了创新治疗策略。

　　

在抗菌药物研发领域，我们正面临着一个严峻的双重挑战：一方面，ESKAPE病原体（包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）引发的感染日益猖獗，这些"超级细菌"对现有抗生素表现出越来越强的耐药性；另一方面，当这些病原体引发脑膜炎等中枢神经系统感染时，血脑屏障这一天然防线又极大地限制了药物入脑效率，导致治疗效果不佳。传统抗生素在应对持久菌和成熟生物膜时往往力不从心，而天然宿主防御肽虽然具有广谱抗菌活性，但其稳定性差、合成成本高的缺点限制了临床应用。

在这一背景下，华东理工大学刘润辉教授团队另辟蹊径，将目光投向了双胍这一正电性基团。与传统的胺基和胍基相比，双胍基具有更高的正电荷密度，能够通过双齿氢键与细菌膜磷脂酰甘油产生更强相互作用。更重要的是，这种独特的正电特性还可能促进其通过吸附介导的转胞吞作用穿透血脑屏障。基于这一创新设计思路，研究人员在《Nature Communications》上报道了一种双胍功能化的聚(2-噁唑啉)宿主防御肽模拟物PBGProOx₂₀，为解决耐药性ESKAPE病原体感染和脑膜炎治疗难题提供了新方案。

研究团队主要运用了高分子合成化学方法制备了一系列侧链间隔基和链长不同的双胍功能化聚(2-噁唑啉)，通过凝胶渗透色谱和核磁共振氢谱进行表征；采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度评估抗菌活性，通过溶血实验和细胞毒性实验评估生物相容性；利用时间杀灭曲线、持久菌和生物膜清除实验评价抗菌性能；通过荧光成像、扫描电镜、透射电镜、膜电位检测等技术阐明抗菌机制；采用等温滴定量热法分析聚合物与磷脂的相互作用；通过RNA测序进行耐药性演化研究；建立小鼠全层感染、皮下感染、肾脏感染、腹膜炎和脑膜炎模型评估体内疗效；利用Transwell模型、斑马鱼模型和小鼠体内分布实验评价血脑屏障穿透能力。

双胍功能化聚(2-噁唑啉)的合成与表征

研究人员通过甲基三氟甲磺酸酯引发的2-噁唑啉聚合，随后进行N-Boc脱保护和双胍化反应，成功合成了一系列具有不同侧链间隔基（甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷）的双胍功能化聚(2-噁唑啉)。所有聚合物均具有约20个重复单元和较窄的分子量分布。核磁共振氢谱分析证实，双胍基团的强吸电子效应和高电荷密度导致质子峰明显低场位移，且未观察到未转化胺基的残留峰，表明功能化反应完全。

体外抗菌活性与毒性

抗菌活性测试显示，双胍功能化聚(2-噁唑啉)对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和粪肠球菌）的MIC值为6.25-12.5μg/mL。其中，带有丙烷侧链间隔基的PBGProOx₂₀对革兰氏阴性菌（包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌）表现出最优异的抗菌活性，MIC值为6.25-25μg/mL。值得注意的是，这些聚合物对红细胞溶血性可忽略不计，对COS7肾细胞的IC₅₀值超过400μg/mL。PBGProOx₂₀对所有耐药性ESKAPE病原体的抗菌选择性指数超过80（HC₁₀/MIC）和32（IC₅₀/MIC），显著优于已批准的消毒剂聚六亚甲基双胍。

PBGProOx₂₀的广谱抗菌性能

时间杀灭动力学实验表明，PBGProOx₂₀在2×MIC和4×MIC浓度下可在3小时或2小时内完全清除指数生长期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。更令人印象深刻的是，PBGProOx₂₀在4×MIC浓度下24小时内可清除超过6个对数值的持久菌，而高剂量环丙沙星或氨苄青霉素处理的持久菌仍保持存活。在成熟生物膜清除实验中，PBGProOx₂₀在16×MIC和8×MIC浓度下即可有效清除金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物膜，而万古霉素和黏菌素即使在高浓度下效果有限。

PBGProOx₂₀的抗菌机制

通过荧光标记聚合物和时间推移共聚焦成像观察发现，PBGProOx₂₀可在1分钟内快速积累在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的膜上。约11分钟后，荧光信号在金黄色葡萄球菌胞质中出现，表明膜损伤导致聚合物和碘化丙啶进入细菌细胞。扫描电镜和透射电镜表征显示，PBGProOx₂₀处理导致细菌膜明显皱缩、破裂，细胞内含物泄漏并形成大量内部空腔。与胺基和胍基功能化聚合物相比，PBGProOx₂₀诱导更显著的膜去极化、膜电位变化和膜流动性降低，更有效地扰乱细菌稳态和质子动力。

防止耐药性进化

连续32代在0.5×MIC浓度下处理，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未对PBGProOx₂₀产生耐药性，而环丙沙星和莫西沙星处理的细菌分别出现512倍和32倍的MIC值增加。RNA-seq分析显示，PBGProOx₂₀处理组差异表达基因数量远少于抗生素处理组，且几乎未上调任何外排泵家族相关基因。相反，PBGProOx₂₀显著下调了多种毒力因子相关基因（如hlgA、hlgB、hlgC、efb和ecb），这可能有助于减轻耐药菌引起的炎症损伤。

小鼠局部和全身性细菌感染的广谱治疗效果

在多种感染模型中，PBGProOx₂₀展现出卓越的治疗效果。在全层伤口感染模型中，局部应用PBGProOx₂₀使金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别减少2.2和2.6个对数值，优于万古霉素和亚胺培南。在肾脏感染模型中，全身给药显著降低感染肾脏中的细菌负荷，并减轻肾小球和肾小管坏死。在腹膜炎模型中，单剂量PBGProOx₂₀显著提高存活率，挽救83%的金黄色葡萄球菌感染小鼠，以及100%的表皮葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌感染小鼠。

细胞穿透和血脑屏障穿透特性

罗丹明标记的PBGProOx₂₀在脑微血管内皮细胞中表现出高效内化，主要通过巨胞饮和网格蛋白依赖性内吞途径。Transwell模型显示PBGProOx₂₀的转运比在24小时内达到约26%，且不破坏紧密连接。体内实验证实，全身给药后PBGProOx₂₀在脑中分布水平与心、脾、肺相当，斑马鱼模型中也观察到脑区的明显荧光信号，证明其具有血脑屏障穿透能力。

细菌性脑膜炎的抗菌疗效和体内毒性

在细菌性脑膜炎模型中，PBGProOx₂₀全身给药显著提高存活率，挽救83%的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染小鼠，优于万古霉素，与美罗培南相当。组织学检查显示PBGProOx₂₀治疗有效减轻感染脑部的炎症。安全性评价表明，PBGProOx₂₀的最大耐受剂量约为300mg/kg，远高于聚六亚甲基双胍（20mg/kg），且对血液学参数和血液生化指标无显著影响。

本研究通过创新性地将双胍基团作为正电性基团引入宿主防御肽模拟物设计，开发出具有广谱抗菌活性和血脑屏障穿透能力的PBGProOx₂₀。该聚合物通过靶向细菌膜磷脂酰甘油发挥抗菌作用，不易诱导耐药性产生，在多种感染模型中展现出卓越治疗效果，特别是对传统抗生素难以奏效的细菌性脑膜炎。这一研究不仅为治疗耐药性ESKAPE病原体感染提供了新策略，也为开发中枢神经系统感染治疗药物开辟了新途径。双胍设计范式为下一代抗菌剂的开发提供了强大平台，其血脑屏障穿透效能也为治疗其他中枢神经系统感染或作为神经治疗递送平台提供了可能。