一种高效Burkholderia聚酮酰基-CoA硫解酶实现三乙酸内酯的高效生物合成

《Nature Communications》：A highly active Burkholderia polyketoacyl-CoA thiolase for production of triacetic acid lactone

本研究针对传统2-吡喃酮合成酶(2-PS)合成三乙酸内酯(TAL)效率低、依赖丙二酰-CoA的瓶颈，发现聚酮酰基-CoA硫解酶BktB可通过非脱羧Claisen缩合以乙酰-CoA为底物高效合成TAL。研究人员从数千个同源酶中筛选出活性提高30倍的BktBbr，通过结构解析与理性设计进一步优化酶活，最终在工程化大肠杆菌中实现2.8 g L-1的TAL产量，为可持续生物制造提供了新策略。

　　

在追求绿色可持续制造的浪潮中，微生物生物合成技术正成为替代石油化工路线的重要选择。三乙酸内酯(Triacetic acid lactone, TAL)作为一种极具价值的平台化学品，可用于合成食品防腐剂、香料和聚合物等多种产品，被归类为“生物特权分子”(bio-privileged molecule)。传统上，TAL的生物合成主要依赖于2-吡喃酮合成酶(2-pyrone synthase, 2-PS)催化的脱羧Claisen缩合反应，该途径以丙二酰-CoA为延伸单元。然而，这一路线存在明显局限性：需要消耗ATP将乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA，且受到乙酰-CoA羧化酶(ACC)的变构抑制，同时丙二酰-CoA还会与脂肪酸生物合成等天然途径竞争。

2020年，Tan等人发现Cupriavidus necator来源的BktB是一种聚酮酰基-CoA硫解酶(polyketoacyl-CoA thiolase)，能够通过非脱羧Claisen缩合(non-decarboxylative Claisen condensation)以乙酰-CoA为前体和延伸单元合成TAL。这一途径绕过了丙二酰-CoA的依赖，展现出显著优势。然而，原始酶BktBcn的活性有限，制约了其应用潜力。

针对这一挑战，联合生物能源研究所(Joint BioEnergy Institute)等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员通过大规模同源酶挖掘，从数千个BktB同源酶中筛选获得五个具有TAL生产活性的硫解酶。其中，来自Burkholderia sp. RF2-non_BP3的BktBbr表现出卓越性能，其体外活性比原始酶BktBcn提高约30倍，在工程化大肠杆菌中也支持高出30倍的TAL产量。

为开展这项研究，团队运用了多项关键技术：通过系统发育分析从Uniprot数据库中筛选同源酶；利用α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)偶联测定法进行酶动力学分析；采用X射线晶体学解析BktBbr与不同CoA酯复合物的高分辨率结构；通过理性设计对CoA结合通道的关键氨基酸进行定点突变；利用工程化大肠杆菌JBEI-3695(缺失adhE、ldhA、frdBC和pta基因)进行体内TAL生产评估；在生物反应器中开展补料分批发酵优化生产工艺。

鉴定具有三乙酸内酯生产活性的BktB同源酶

研究人员首先对来自Cupriavidus necator的BktBcn蛋白序列进行同源酶挖掘，从Uniprot数据库获得2910个硫解酶序列。通过构建系统发育树，从三个不同进化距离簇中选出六个BktB候选酶进行实验验证。体外实验表明，除几乎不溶的BktBrs外，其余六个BktB均能将乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA转化为TAL，其中Burkholderia来源的BktB表现出更快的TAL生成速率。

Burkholderia BktBs具有卓越的酶活性

蛋白序列比对发现，所有七个BktB在活性位点残基C90、N317、H350、C380和G382以及对硫解酶活性重要的α-螺旋-5区域完全保守。动力学分析显示，三种Burkholderia BktB的活性显著高于其他BktB，特别是BktBbr的活性比BktBcn高出近30倍。研究人员还观察到BktBcn、BktBcl和BktBct在高浓度乙酰乙酰-CoA(200μM)下TAL合成活性受到显著抑制，而Burkholderia BktB即使在高浓度乙酰乙酰-CoA存在下也不受影响。

使用表达BktB的工程化大肠杆菌生产TAL

将测试的BktB编码基因与2-PS及阴性对照RFP克隆到pBbA5a载体中，并转化至工程化大肠杆菌JBEI-3695。表达BktB的菌株在24孔板中培养48小时后，表达Burkholderia BktB的菌株产量超过75 mg L^-1TAL，而其他BktB仅产生约10 mg L^-1。携带BktBbr的大肠杆菌产生0.3 g L^-1TAL，为BktBcn的30倍。通过使用不同拷贝数和启动子强度的载体，最终在强启动子pBbE1a控制下获得0.8 g L^-1的TAL产量。

补料分批生产TAL

在5天的生产期内，以葡萄糖或甘油为碳源进行补料分批发酵。结果显示，使用甘油时细胞生长更快，但使用葡萄糖时TAL产量更高。葡萄糖为碳源时TAL产量达2.8 g L^-1，葡萄糖得率为0.11 g g^-1。研究还发现TAL对大肠杆菌存在一定毒性，在LB培养基中IC₅₀约为1.0 g L^-1，而在营养更丰富的LB-plus培养基中IC₅₀提高至3.0 g L^-1。

利用高分辨率X射线结构工程化改造BktB

研究人员成功解析了BktBbr的apo结构(PDB ID: 9BWK)以及与乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA和丁酰-CoA复合物的高分辨率X射线结构(PDB ID: 9BWO、9BWP、9BWL)。结构分析发现，BktBbr以四聚体形式存在，具有特殊的环区稳定四聚体结构。删除该环区会消除95%以上的TAL产量。与CoA酯共价结合的结构显示，乙酰-CoA和丁酰-CoA在活性口袋内具有相同的蛋白-配体相互作用，而乙酰乙酰-CoA由于额外酮基的位阻效应，主要通过水分子介导与BktB的相互作用。

基于结构发现，研究人员设计了12个突变体 scrutinize 单个氨基酸在蛋白-配体相互作用中的作用。筛选发现，位于CoA结合通道的I256A突变导致酶活性几乎完全丧失，而S254A、G255A和G251A突变显著提高了TAL产量。这些突变体的共同特征是降低了底物通道中的CoA结合亲和力。纯化的S254A和G251A突变体在体外实验中表现出比野生型更好的酶活性。

通过比较BktBcn和BktBbr的结构，研究人员将BktBbr的不同 motif 移植到BktBcn中。其中，远离活性位点的AES117-119SEN突变使TAL产量提高2.5倍。结构比较表明，从丙氨酸到丝氨酸和丝氨酸到天冬酰胺的侧链变化可能影响酶的动力学和活性。

本研究发现的高效硫解酶BktBbr为TAL生产提供了一条替代2-PS的有效途径。虽然BktB尚未达到2-PS报告的最高滴度(如Yarrowia lipolytica中的35.9 g L^-1)，但其通过乙酰-CoA和非脱羧Claisen缩合的机制独特路线避免了ATP消耗和CO₂释放，具有更高的理论碳和能量效率。BktB介导的生产过程中观察到的较高得率(0.11 g TAL g^-1葡萄糖)证明了这一优势。

高分辨率X射线结构使理性突变成为可能，针对底物通道和CoA结合区域的工程改造显著提升了催化活性。隧道入口附近的残基如S254和G251能够调节CoA可及性并潜在稳定链延伸过程中的过渡态。这些发现表明，微调底物隧道几何结构和CoA配位对增强聚酮硫解酶活性至关重要，为未来的酶工程工作提供了蓝图。

鉴于许多天然产物可能由TAL合成，更高效的BktB变体仍有待发现。继续探索BktB同源酶，结合结构和功能见解，将深化我们对硫解酶进化的理解，并进一步推进有价值化学品的可持续生物制造。