NAD依赖型甲醇脱氢酶的过氧化特性鉴定及其对合成甲基营养体的意义

《Nature Communications》：Identification of overoxidizing and non-overoxidizing NAD-dependent methanol dehydrogenases and implications for synthetic methylotrophy

本研究针对合成甲基营养型大肠杆菌在利用甲醇生长时积累甲酸盐的问题，发现广泛使用的NAD依赖型甲醇脱氢酶(Mdh)普遍存在将甲醇过氧化为甲酸盐的现象。研究人员通过筛选发现来自甲醇芽孢杆菌的Mdh/Mdh1型酶能专一氧化甲醇为甲醛，并通过体外实验验证其非过氧化特性。该研究为天然甲基营养体中多重mdh基因的存在提供合理解释，并为优化合成甲基营养体提供了新策略。

　　

随着温室气体排放引发的全球气候危机日益严峻，化学工业作为主要排放源亟需向可持续发展转型。甲醇作为一种可由温室气体或生物质规模化生产的可再生一碳化合物，成为替代化石原料的理想选择。天然甲基营养体虽能利用甲醇，但尚未实现工业化应用。近年来，通过导入核酮糖单磷酸(RuMP)循环和甲醇氧化酶系统，科学家成功将大肠杆菌改造为合成甲基营养体，然而在甲醇生长过程中会出现甲酸盐大量积累的现象，导致碳损失和产量下降。

为探究甲酸盐积累的根源，苏黎世联邦理工学院的Philipp Keller等研究人员在《Nature Communications》发表研究，系统揭示了NAD依赖型甲醇脱氢酶的过氧化特性及其对合成甲基营养体的影响。研究发现，来自耐金属贪铜菌的Mdh2 CT4-1 Cn不仅能氧化甲醇为甲醛，还能进一步将甲醛过氧化为甲酸盐。通过体内外实验证实，这种过氧化特性普遍存在于多数NAD依赖型Mdh中，而甲醇芽孢杆菌来源的Mdh/Mdh1型酶则能专一催化甲醇至甲醛的氧化反应。

同位素示踪实验表明，甲酸盐95%以上来源于甲醇，而非丙酮酸。通过构建甲醛解毒途径缺失菌株，排除内源性甲醛氧化途径的干扰，确认Mdh是甲酸盐产生的直接原因。

体外酶学分析显示，Mdh2 CT4-1 Cn催化甲醛氧化的速率显著高于甲醇氧化。系统发育分析将测试的Mdh分为过氧化和非过氧化两个明显分支，其中非过氧化酶属于Mdh/Mdh1簇，与过氧化酶序列相似性低于70%。

对代表性非过氧化酶Mdh Bm MGA3的深入表征发现，该酶在甲醛存在时不产生NADH，即使添加激活蛋白Act或改变反应温度，也未检测到甲醛氧化活性。热力学平衡实验进一步验证了Mdh Bm MGA3仅催化甲醇至甲醛的氧化，而Mdh2 CT4-1 Cn能将反应推至甲酸盐生成。

序列比对发现24个在两类酶中保守但存在差异的残基，这些残基分布在活性中心周围，可能与底物选择性相关。

应用研究表明，在甲醇依赖型大肠杆菌中用Mdh Bm MGA3替代Mdh2 CT4-1 Cn，可使甲酸盐积累量降低13倍，证明非过氧化Mdh在减少碳损失方面的优势。

研究采用的关键技术包括：同位素标记示踪分析甲酸盐来源、多物种NAD依赖型Mdh酶的体内功能筛选、蛋白质纯化与体外酶动力学测定、热力学平衡分析、系统发育树构建与序列比对、结构预测与活性位点分析、适应性实验室进化培育甲醇依赖型菌株等。

研究结果部分显示，合成甲基营养型大肠杆菌在甲醇生长过程中确实积累mM级甲酸盐，同位素示踪证实甲酸盐主要来自甲醇。NAD依赖型甲醇脱氢酶普遍存在过氧化现象，但Mdh/Mdh1型酶能专一氧化甲醇为甲醛。体外实验验证Mdh Bm MGA3不催化甲醛氧化，且该特性不受激活蛋白影响。序列分析发现两类酶的活性中心残基存在差异。应用非过氧化Mdh能显著减少甲酸盐积累。

该研究首次系统揭示NAD依赖型甲醇脱氢酶的过氧化特性，为理解天然甲基营养体中多重mdh基因的生理功能提供新视角。研究结果对优化合成甲基营养体、提高甲醇生物转化效率具有重要指导意义，为建立基于甲醇的循环碳经济奠定基础。