革兰氏阴性菌多粘菌素耐药新机制：ArnC糖基转移酶的结构基础与催化机理

《Nature Communications》：Structural basis of undecaprenyl phosphate glycosylation leading to polymyxin resistance in Gram-negative bacteria

本研究针对革兰氏阴性菌中多粘菌素耐药性这一临床挑战，通过冷冻电镜技术解析了ArnC糖基转移酶在apo状态和核苷酸结合状态下的高分辨率结构，揭示了该酶通过"钟摆式"构象变化实现底物识别的分子机制。结合分子动力学模拟，研究人员提出了UndP糖基化反应的催化机理，为开发逆转多粘菌素耐药性的新型药物提供了重要靶点。

　　

在抗生素耐药性日益严重的全球公共卫生危机中，多粘菌素作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的"最后一道防线"，其耐药性问题尤为突出。革兰氏阴性菌通过修饰其外膜脂多糖(LPS)中的脂质A(Lipid A)组分来降低膜表面负电荷，从而减少多粘菌素等阳离子抗菌肽的结合。其中，最为有效的修饰方式是在脂质A的磷酸基团上添加4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)，这一修饰能显著降低细菌膜表面的负电荷，从而产生对多粘菌素的耐药性。

实现这一修饰的关键步骤在于ArnC酶催化的糖基化反应。作为多萜醇磷酸糖基转移酶(Pren-P GT)家族成员，ArnC负责将氨基阿拉伯糖从UDP-L-Ara4FN供体转移至十一异戊二烯磷酸(UndP)脂质载体。尽管ArnC在多粘菌素耐药性中具有关键作用，但其三维结构及催化机制长期以来未被阐明，限制了针对该靶点的药物开发。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员成功解析了来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的ArnC酶在apo状态和UDP结合状态下的高分辨率冷冻电镜结构，并结合分子动力学模拟深入揭示了其催化机制。这些发现不仅阐明了ArnC的工作原理，也为设计能够逆转多粘菌素耐药性的新型抑制剂提供了结构基础。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过冷冻电镜单颗粒分析获得了ArnC在脂质纳米盘中的高分辨率结构；利用微量热泳动技术测定ArnC与底物的结合亲和力；采用粗粒化和原子分子动力学模拟研究底物结合和催化机制；使用脂质纳米盘技术为膜蛋白提供近天然环境；通过分子对接和模拟构建酶-底物复合物模型。

结构测定

研究人员首先通过筛选不同来源的ArnC同源蛋白，最终选择表达量高、稳定性好的沙门氏菌ArnC(ArnCse)进行结构解析。将ArnCse重组至POPC/POPG脂质纳米盘中，利用冷冻电镜技术分别解析了apo状态(2.74?和2.79?)和UDP结合状态(2.96?)的三维结构。这些结构显示ArnC以四聚体形式存在，每个单体包含一个胞质糖基转移酶GT结构域、两个跨膜螺旋和两个膜旁螺旋。

apo ArnC的结构

ArnC的单体结构特征为：N端胞质区呈现典型的GT-A折叠，由8条β链组成的混合β片层和两侧的α螺旋构成。保守的DXD motif(100DADLQN105)位于β4和α4之间的环上，负责协调催化金属离子和供体底物。两个膜旁螺旋(JM1和JM2)平行排列，疏水面朝向膜。跨膜结构域形成八螺旋束，C端短β发夹与相邻单体相互作用，稳定四聚体组装。

UDP结合ArnC的结构

通过微量热泳动实验发现，Mn²⁺存在时ArnC与UDP的结合亲和力最高(K_d=8.5μM)。在Mn²⁺和UDP存在下解析的冷冻电镜结构显示，UDP核苷酸结合在GT结构域的浅裂中，D102和Q104直接与Mn²⁺离子配位，后者又协调UDP的二磷酸基团。与apo状态相比，UDP结合引发了显著的构象变化：GT结构域像"钟摆"一样向上旋转13.7°，不同部分发生2.7-7.7?的平移，使活性位点更加封闭。

构象转变

比较apo和UDP结合状态的结构发现，核苷酸结合引发了典型的"蛤壳"运动，使GT结构域更靠近膜旁螺旋和膜。这一构象变化可能代表酶催化循环中较快的动力学组分，为后续脂质受体UndP的结合创造了条件。

UndP结合模式

通过粗粒化分子动力学模拟发现，脂质受体UndP可自发稳定地结合在GT结构域中，其磷酸基团伸出双层平面。原子模拟进一步表明，UndP的尾部插入JM1和JM2之间形成疏水相互作用，而磷酸头部则被R131和R137协调。这种结合模式与已知的Pren-P GT结构相似，说明JM螺旋在引导脂质受体进入活性位点中起关键作用。

85%的残基显示为棍状并标记。'>

催化机制

通过构建三种酶-底物复合物模型并进行原子分子动力学模拟，研究人员提出了ArnC的催化机制：UndP首先通过JM螺旋进入GT结构域，处于"待命"位置(P1)；随后UDP-L-Ara4FN结合引发构象重排，使UndP移至"催化"位置(P2)；D100作为催化碱从UndP磷酸基团抽取质子，激活受体进行亲核攻击，直接攻击L-Ara4FN糖的C1原子，形成UndP-L-Ara4FN并释放UDP。

研究结论表明，ArnC通过精巧的构象变化和底物协调机制，实现了对UndP的糖基化修饰。该酶采用双位点模型，脂质受体先进入待命位置，核苷酸供体结合后触发构象变化，使脂质进入催化位置完成反应。特别值得注意的是，DXD motif中的第一个天冬氨酸(D100)不参与金属离子配位，而是作为催化碱激活脂质受体，这一机制可能普遍适用于所有Pren-P GT家族酶。

这项研究不仅首次揭示了ArnC的三维结构和工作机制，更重要的是为针对多粘菌素耐药性的药物设计提供了精准的靶点信息。通过靶向ArnC的活性位点或构象变化过程，可能开发出能够阻断L-Ara4N修饰的新型抑制剂，从而恢复多粘菌素对多重耐药革兰氏阴性菌的疗效。鉴于多粘菌素在临床上的关键地位，这一研究对应对日益严峻的抗生素耐药性挑战具有重要战略意义。