Endo-GeneScreen平台：在生理背景下调控内源蛋白水平的药物样探针发现新策略

《Nature Communications》：The Endo-GeneScreen platform identifies drug-like probes that regulate endogenous protein levels within physiological contexts

本研究针对传统表型药物发现平台可扩展性差、机制不明确等瓶颈，开发了Endo-GeneScreen（EGS）高通量平台。该平台能够在疾病建模背景下筛选调控特定靶基因内源蛋白水平的小分子，成功发现40余个可提升神经元SynGAP1蛋白的化合物。概念验证分子SR-1815通过调控剪接恢复SynGAP蛋白至野生型水平，纠正Syngap1单倍体不足导致的突触和神经元功能异常，为神经发育障碍治疗提供了新策略。

　　

在当今药物研发领域，传统靶向策略虽然方向明确，但往往无法捕捉复杂生物系统的整体响应；而表型筛选虽能发现全新作用机制的化合物，却常面临可扩展性差和机制不明确的困境。这种两难处境在神经发育障碍研究中尤为突出——例如由SYNGAP1基因单倍体不足引起的智力障碍、自闭症和癫痫，尽管其病理机制逐渐清晰，却缺乏能够直接提升功能性蛋白表达的有效治疗手段。

针对这一挑战，研究团队在《Nature Communications》上报道了全新的Endo-GeneScreen（EGS）平台，该平台巧妙整合了内源蛋白检测、实验室自动化和大规模药物样分子库，能够在生理相关背景下直接筛选调控特定靶蛋白表达的小分子化合物。选择Syngap1作为概念验证靶点具有多重考量：该基因是神经发育障碍的常见遗传病因，主要在大脑皮层兴奋性神经元中发挥功能，且已有成熟的疾病模型可供验证。

技术方法的核心在于建立可扩展的双荧光素酶报告基因（DLR）检测体系，通过在Syngap1基因中嵌入HiBIT标签，使其与LargeBIT蛋白结合后激活荧光信号，从而实时监测内源SynGAP蛋白的动态变化。研究使用原代小鼠皮层神经元（来自Syngap1-HiBIT基因敲入小鼠）进行高通量筛选，通过双信号读取（nBIT代表SynGAP表达，fLUC反映总蛋白变化/毒性）实现了对10万多个化合物的高效评估。

开发原发性细胞双荧光素酶报告基因检测方法以检测内源靶蛋白表达变化

研究团队通过基因工程手段构建了三种小鼠品系：条件性Syngap1敲除小鼠、组成性表达荧光素酶（fLUC）的转基因小鼠、以及在Syngap1基因中敲入HiBIT标签的小鼠。这些品系杂交后产生的后代神经元同时携带SynGAP-HiBIT融合蛋白报告基因和fLUC对照报告基因。当HiBIT标签与纯化的LargeBIT蛋白结合时，可重建具有催化活性的NanoBIT荧光素酶（nBIT），其信号强度与内源SynGAP蛋白含量成正比。验证实验表明，该检测系统在384孔板中能够准确区分SynGAP蛋白的生理性变化，信噪比超过10³，且板间变异系数低于15%，完全符合高通量筛选要求。

EGS检测支持高通量筛选化学库进行先导化合物识别

团队进行了两轮独立筛选，总计评估超过10万个药物样小分子。第一轮筛选采用保守的48小时化合物孵育策略，通过离群值算法识别选择性上调nBIT信号的化合物，发现127个初步活性化合物（命中率0.21%）。基于首轮经验，第二轮筛选优化了工作流程：延长孵育时间至96小时、采用单一测试浓度（3.125μM）、并在每板加入阳性对照。改进的命中识别算法考虑了fLUC与nBIT信号的内在相关性，通过设置斜率阈值线和"非重复性"值过滤，最终获得171个高置信度命中化合物（命中率0.36%）。

EGS检测支持初步筛选命中化合物的生物学验证

研究团队建立了五级验证流程，对SR-1815进行了全面表征。该化合物在剂量依赖性实验中显著提升nBIT信号，且细胞外实验排除了直接激活荧光素酶活性的可能。团队开发的点印迹（Dot Blot）蛋白检测技术结合384阵列针具、硝化纤维素膜和KO验证抗体，证实SR-1815可使单倍体不足神经元中的SynGAP蛋白水平翻倍，且对多种C末端异构体均有提升作用。

免疫荧光研究进一步揭示，SR-1815主要增强突触区SynGAP信号（提升约4倍），而对胞体信号影响较小。共聚焦显微镜分析显示，药物处理后突触后密度蛋白PSD-95信号同步增加约3倍，而突触前标志物SV2A仅轻微变化（1.3倍），表明SR-1815特异性调控突触后结构功能。

概念验证小分子SR-1815纠正Syngap1单倍体不足神经元的突触功能异常和神经元活动增强

功能验证表明，SR-1815能够基因型特异性地双向调节兴奋性突触功能：在野生型神经元中轻微增强微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率和振幅，而在单倍体不足神经元中则显著降低这些参数。钙成像实验进一步证实，该化合物可将过度活跃的杂合突变神经元活动水平调节至接近野生型状态，且呈现剂量依赖性效应。对第二轮筛选获得的先导化合物进行验证，最终确认40余个能够有效上调SynGAP表达的验证分子。

加速EGS鉴定先导化合物的临床前开发

团队通过"购买式构效关系"策略，快速获取了100个SR-1815结构类似物，大大加速了临床前开发进程。结构修饰耐受性分析发现，吡唑环的5位（R2）和尿素1位氮原子可接受多种取代，而C5酰胺和环脲核心对活性至关重要。这一策略证明了EGS检测体系足以支持构效关系研究指导下的先导化合物优化。

研究结论强调，EGS平台的核心优势在于能够在转化相关背景下发现调控疾病相关蛋白表达的化合物。作为概念验证，SR-1815是当前唯一已知能够在单倍体不足神经元中将SynGAP丰度恢复至野生型水平的小分子，同时缓解Syngap1功能缺失导致的主要细胞表型。平台模块化设计使其可适配不同基因靶点和疾病模型，不仅适用于单倍体不足障碍，也为研究获得性功能突变相关疾病提供了新思路。

值得注意的是，EGS平台兼具治疗开发与生物学发现的双重价值。如平行研究所示，SR-1815作为多激酶抑制剂，通过调控Syngap1转录本剪接发挥作用，其部分激酶靶点与癌症生物学相关，体现了平台在跨疾病领域发现新生物学的潜力。尽管当前先导化合物存在脑渗透性差、半衰期短等局限性，但平台已成功产出40余个具备开发潜力的分子实体，为治疗SYNGAP1相关神经发育障碍及其他单倍体不足疾病奠定了坚实基础。