周期性非对称场增强纳米尺度脂质系统电融合：一种用于高效制备细胞膜杂交脂质纳米粒的微流控新策略

《Nature Communications》：Periodic asymmetric field enhances electrofusion of nanoscale lipid systems

本研究针对传统电融合技术应用于纳米尺度药物载体（如细胞膜杂交LNP）时存在的介电响应弱、粒子动力学不可控等难题，开发了一种结合微流控流场与周期性电场的周期性非对称场（PAF）新策略。通过计算流体动力学模拟系统阐明了其增强融合效率的机理（Δc*syn= Δc*LNP·Δc*CM），并据此研制了PAF引导的微流控电融合装置（PAF-MED）。所制备的间充质干细胞膜杂交LNP（MSC-cLNP）在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化（PF）模型中显示出优异的靶向损伤肺上皮细胞（LEC）能力和转化生长因子β1（TGF-β1）siRNA递送效率，显著缓解了纤维化进程。该工作为纳米尺度脂质系统的可控组装提供了新范式。

　　

在生物技术和纳米医学领域，如何将不同类型的纳米颗粒高效、可控地融合在一起，是一个充满挑战的前沿课题。电融合技术，作为一种通过施加可控电场诱导生物膜融合的经典方法，因其快速、无需化学试剂且能保持膜蛋白完整性等优势，在构建杂交脂质结构方面展现出巨大潜力。然而，当研究对象从细胞等微米尺度的对象转向脂质纳米粒（LNP）这类纳米尺度的先进药物载体时，传统电融合技术就显得力不从心了。这是由于纳米颗粒尺寸微小，导致其在电场下的介电响应极其微弱，加之粒子运动难以控制，使得融合效率低下且易造成不可逆的膜损伤。

为了攻克这一纳米尺度操控的难题，来自浙江大学等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究。他们独辟蹊径，将目光投向了非对称场（AFs）。这类具有空间非均匀动态特性的场，能够通过精巧的结构设计和流动参数控制，实现对粒子运动轨迹的精确时空操控。受此启发，研究人员设想：能否设计一种特殊的场，不是用来分离粒子，而是用来促进不同纳米颗粒之间的碰撞与融合呢？

答案是肯定的。本研究报道了一种名为周期性非对称场（PAF）的全新策略，它巧妙地将微流控流场与周期性电场耦合，形成一种时空调制的混合场。研究人员选择具有良好生物相容性和功能多样性的细胞膜杂交LNP（cLNP）作为模型纳米颗粒，系统性地探索了PAF增强纳米电融合的奥秘。

为了深入理解PAF的作用机制，研究团队首先构建了一个基于电流体动力学（EHD）原理的多物理场计算流体动力学（CFD）模拟框架。模拟结果揭示，在PAF中，带电粒子会呈现出沿流动方向（x轴）的周期性空间分布，这与正交均匀交变场下的粒子分离现象形成鲜明对比。这种独特的、高度局域化的粒子轨迹调制，导致了LNP和细胞膜（CM）浓度的周期性波动。研究人员定义了一个关键参数——归一化局部浓度波动强度Δc^*，并发现LNP和CM两者波动强度的乘积Δc^*_syn与实验测得的融合效率呈显著正相关（R2 = 0.96）。这表明，动态浓度梯度通过调节粒子碰撞概率，是驱动融合过程的关键。

基于白金汉π定理（Buckingham π theorem）的量纲分析，研究人员进一步确定了三个关键的无量纲参数：几何限制因子（ξ₁）、电极不对称参数（ξ₂）和电-粘性力比（ξ₃），并推导出了Δc^*与这些参数之间的半经验方程，为PAF系统的设计与优化提供了坚实的理论预测模型。

在理论模拟的指导下，研究人员设计并制备了PAF引导的微流控电融合装置（PAF-MED）。该装置集成了LNP制备与载药、防返流、LNP-CM混合以及电融合等多个功能模块。

通过系统优化微流道结构、电极配置（如50μm通道高度、50:50 μm的电极-间隙比例）、脉冲参数（10 V, 12.5 kHz方波脉冲）以及合成条件（如CM与LNP数量比1:1，胆固醇含量10%，1x PBS缓冲液浓度），PAF-MED能够高效、可控地合成出尺寸均一（约135 nm）、多分散指数（PDI）低（约0.1）的cLNP，融合效率超过90%。

研究团队验证了PAF-MED在不同细胞膜类型（如间充质干细胞MSC、巨噬细胞、红细胞、中性粒细胞、上皮细胞TC-1、肿瘤细胞Caco-2）和不同电荷属性LNP（阳离子、中性、阴离子）制备cLNP方面的普适性和兼容性。以具有损伤靶向性的MSC膜杂交LNP（MSC-cLNP）为代表模型，与传统的超声法和共挤出法制备的cLNP进行比较，发现PAF-MED制备的cLNP能更好地保留膜蛋白的二级结构（尤其是α-螺旋结构）和关键靶向蛋白（如CXCR4, VLA-4, CD44, CD47）的正确膜外取向，同时对小干扰RNA（siRNA）的包封效率接近100%，显著优于传统方法。

在功能验证方面，体外实验表明，PAF-MED制备的MSC-cLNP在博来霉素（BLM）损伤的肺上皮细胞（LEC）模型中展现出更强的细胞摄取能力和更有效的TGF-β1基因沉默效果。在BLM诱导的小鼠肺纤维化（PF）模型中，通过吸入给药的TGF-β1-siRNA封装的MSC-cLNP（PAF-MED制备）在肺组织中滞留时间更长，对损伤LEC的靶向性更优，并能最有效地降低肺组织内TGF-β1和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达水平，减少羟脯氨酸（HYP）含量（胶原沉积标志物），显著减轻肺组织纤维化病变和胶原沉积，表现出最佳的治疗效果。

本研究主要应用了以下几项关键技术方法：通过计算流体动力学（CFD）多物理场耦合模拟分析周期性非对称场（PAF）中粒子动力学；采用软光刻和紫外光刻技术制备集成叉指电极阵列的微流控电融合装置（PAF-MED）；利用弗斯特共振能量转移（FRET）系统定量评估膜融合效率；通过低温透射电镜（cryo-TEM）、圆二色光谱（CD）、斑点杂交（Dot blot）等技术表征cLNP的形貌、膜蛋白结构和靶蛋白取向；使用来自C57BL/6小鼠的原代细胞（如骨髓来源的MSC、红细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）制备细胞膜；并最终在BLM诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化（PF）模型中通过吸入给药评估cLNP的体内靶向性和治疗 efficacy。

结果部分简要归纳

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  基于CFD分析的PAF系统研究：通过多物理场CFD模拟，揭示了PAF通过诱导LNP和CM产生周期性浓度波动（Δc^*）来增强碰撞频率的机制，并建立了基于无量纲参数的半经验预测模型，实验验证了该模型对关键参数（如通道高度、电极对称性、粒子电荷）与融合效率关系的预测准确性。
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  PAF-MED的设计与制备：成功设计并制备了集成LNP合成、混合、电融合等多功能模块的PAF-MED装置，通过优化流体速率、脉冲电压频率等参数，实现了对cLNP尺寸、PDI和融合效率的精确控制。
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  PAF-MED制备cLNP的兼容性与表征：PAF-MED方法适用于多种细胞膜类型和不同电荷属性的LNP，制备的cLNP（尤其是MSC-cLNP）具有均一的形态、高的膜蛋白结构完整性和靶蛋白正确取向，以及近乎完全的siRNA包封效率。
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  体内靶向与PF干预：在PF小鼠模型中，PAF-MED制备的MSC-cLNP显示出优异的肺部靶向性和损伤LEC亲和力，能高效递送TGF-β1-siRNA，有效下调TGF-β1和MMP9表达，减少胶原沉积，显著缓解肺纤维化病理进程，效果优于传统方法制备的cLNP。

结论与意义

本研究成功开发了一种利用周期性非对称场（PAF）增强纳米尺度脂质系统电融合的新方法。这项工作不仅从理论上阐明了PAF通过调制纳米粒子轨迹和局部浓度来增强电融合的物理机制，而且通过研制PAF-MED装置，将理论转化为可高效、可控合成高性能cLNP的实用平台。与传统的超声、共挤出等机械融合方法相比，PAF引导的电融合能更好地保持细胞膜蛋白的结构和功能完整性，这对于依赖表面生物分子进行靶向的纳米药物至关重要。该研究为纳米尺度脂质系统的精确操纵和先进杂交纳米药物的制备提供了新的理论框架和技术平台，显著拓展了电融合技术在纳米医学领域的应用边界，尤其在需要高度保留源细胞生物功能的细胞膜衍生囊泡工程方面具有广阔前景。