多巴胺D2受体通过表观遗传机制Kat5/H4K8ac调控胆碱能中间神经元介导的可卡因摄入

《Nature Communications》：Epigenetic regulation of cocaine intake through dopaminergic control of cholinergic interneurons in male mice

本研究揭示了多巴胺D2受体(D2R)通过抑制纹状体胆碱能中间神经元(ChIs)调控可卡因摄入动机的新机制。研究人员发现，可卡因通过D2R-ChIs-乙酰胆碱信号轴，激活组蛋白乙酰转移酶Kat5，诱导H4K8ac表观遗传修饰，进而上调即刻早期基因(IEGs)和毒蕈碱M4受体(M4R)在D1R+中型多棘神经元(MSNs)中的表达，最终增强可卡因的奖赏效应。该研究为可卡因使用障碍提供了新的治疗靶点。

　　

在当今社会，物质使用障碍(Substance Use Disorders, SUDs)已成为一个严重的公共卫生问题，其中可卡因成瘾更是给个人和社会带来巨大负担。尽管科学家们对可卡因的成瘾机制进行了数十年研究，但其背后的神经生物学机制仍未完全阐明。传统观点认为，可卡因主要通过增加脑内多巴胺(Dopamine, DA)水平产生奖赏效应，然而，多巴胺如何与其他神经递系统相互作用调控成瘾行为，仍是该领域的重要科学问题。

纹状体作为奖赏系统的关键脑区，包含90-95%的中型多棘神经元(Medium Spiny Neurons, MSNs)和少量中间神经元。其中，胆碱能中间神经元(Cholinergic Interneurons, ChIs)虽然数量稀少，却在调控纹状体功能中扮演着重要角色。这些神经元同时表达兴奋性的多巴胺D5受体(D5R)和抑制性的D2受体(D2R)，使得多巴胺能信号能够精细调控胆碱能活性。然而，D2R对ChIs的抑制作用在可卡因成瘾中的具体功能及其分子机制，仍有待深入探索。

为了回答这一科学问题，Robert G. Lewis、Lauren Otsuka等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们利用条件性基因敲除技术，构建了胆碱能神经元特异性缺失D2R的小鼠(ChI-D2RKO)，并结合行为学、转录组学和表观遗传学等多学科技术，系统揭示了D2R-ChIs信号轴在可卡因成瘾中的关键作用及分子机制。

研究人员主要运用了几项关键技术：通过静脉自身给药(Intravenous Self-Administration, IVSA)和渐进比率(Progressive Ratio, PR)实验评估小鼠对可卡因的动机行为；利用RNA测序(RNA-sequencing)分析伏隔核(Nucleus Accumbens, NAcc)转录组变化；采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测Kat5蛋白表达；通过荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技术定位特定基因在神经元亚型的表达；运用染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)分析组蛋白修饰富集情况。

absence of D2R signaling in ChIs leads to reduced motivation to self-administer cocaine

研究人员首先通过行为学实验发现，ChI-D2RKO小鼠在可卡因自身给药实验中表现出正常的操作学习能力，但在评估动机水平的渐进比率程序中，其突破点(breakpoint)和主动杠杆按压次数均显著低于野生型(WT)对照组。

这一结果表明，缺失ChIs上的D2R信号并不影响小鼠对可卡因奖赏价值的感知，但显著降低了其获取药物的动机水平。

Loss of D2R signaling in ChIs causes severe alterations of the nucleus accumbens transcriptome

通过RNA测序分析，研究人员发现可卡因处理导致WT小鼠伏隔核中2000多个基因表达发生显著变化，而在ChI-D2RKO小鼠中这种转录组重塑严重受损。

特别值得注意的是，多个与物质使用障碍相关的即刻早期基因(Immediate Early Genes, IEGs)，如Fos、Nr4a1、Egr1和Fosb，在WT小鼠中可被可卡因诱导表达，而在突变小鼠中这种诱导作用消失。基因本体(Gene Ontology)分析显示，这些差异表达基因主要富集在学习记忆、突触可塑性和信号转导等相关通路。

Activation of M4R reduces the effects of cocaine in male WT mice

研究人员发现，可卡因能够特异性上调WT小鼠伏隔核中毒蕈碱M4受体(Muscarinic M4 Receptor, M4R)的表达，而这种上调在ChI-D2RKO小鼠中缺失。通过使用M4R正性变构调节剂(Positive Allosteric Modulator, PAM)VU0467154，他们发现增强M4R活性能够显著降低WT小鼠的可卡因诱导的运动活性和条件性位置偏爱(Conditioned Place Preference, CPP)。

更重要的是，在渐进比率程序中，VU0467154处理显著减少了WT小鼠获得的可卡因输注次数和主动杠杆按压次数，使其行为表型与ChI-D2RKO小鼠相似。

通过荧光原位杂交实验，研究人员进一步证实可卡因诱导的M4R上调主要发生在D1R⁺MSNs中，而在D2R⁺MSNs中未观察到显著变化。

这种区域特异性表明，伏隔核D1R⁺MSNs是ACh-M4R信号调控可卡因效应的关键靶点。

The acetyltransferase Kat5 participates in striatal cocaine effects

转录组分析发现，组蛋白乙酰转移酶(Histone Acetyltransferase, HAT)Kat5(也称Tip60)在WT小鼠伏隔核中可被可卡因显著诱导，而在ChI-D2RKO小鼠中这种诱导作用消失。Kat5已知能够催化组蛋白H4第8位赖氨酸乙酰化(H4K8ac)，这是一种与可卡因效应密切相关的表观遗传标记。

研究人员发现，使用M4R拮抗剂tropicamide能够恢复ChI-D2RKO小鼠中可卡因诱导的Kat5上调和H4K8ac富集。

染色质免疫沉淀实验显示，在WT小鼠中，可卡因处理导致H4K8ac在Fos、Nr4a1、Egr1和M4R基因启动子区显著富集，而这种富集在ChI-D2RKO小鼠中缺失，且可被tropicamide恢复。

Kat5 inhibition prevents the acute and chronic effects of cocaine

为了进一步验证Kat5的功能，研究人员使用了特异性抑制剂NU9056。结果显示，抑制Kat5活性能够完全阻断可卡因在WT小鼠中诱导的运动激活效应，

同时抑制可卡因诱导的Kat5上调和H4K8ac增加。荧光原位杂交结合免疫荧光实验证实，可卡因诱导的Kat5上调和H4K8ac增加主要发生在D1R⁺MSNs中，且可被NU9056特异性抑制。

本研究系统阐明了多巴胺D2受体通过调控纹状体胆碱能中间神经元活性，进而通过Kat5/H4K8ac表观遗传机制调节可卡因摄入动机的神经环路和分子机制。研究不仅揭示了D2R-ChIs-ACh-M4R信号轴在可卡因成瘾中的核心作用，还首次将组蛋白乙酰转移酶Kat5及其催化的H4K8ac修饰与可卡因的长期适应性改变直接联系起来。

这一机制的发现具有重要的转化医学价值。研究表明，M4R正性变构调节剂能够有效降低可卡因摄入而不影响基础运动功能，这为开发可卡因使用障碍的治疗策略提供了新方向。同时，Kat5作为可卡因效应的关键表观遗传调控因子，也可能成为未来药物开发的潜在靶点。

该研究深化了我们对多巴胺和乙酰胆碱系统在成瘾中相互作用的理解，揭示了纹状体微环路中不同神经元类型间复杂的对话机制，为理解物质使用障碍的神经生物学基础提供了新的理论框架。