靶向中性粒细胞胞外诱捕网形成的铜硒纳米酶水凝胶抑制胶质母细胞瘤术后复发

《Nature Communications》：Inhibiting the formation of neutrophil extracellular traps to prevent the recurrence of post-operative glioblastoma

本研究针对胶质母细胞瘤（GBM）术后高复发率的临床难题，发现手术微环境中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）通过促进残留肿瘤细胞增殖迁移驱动复发。研究人员开发了κ-硒化卡拉胶衍生的铜硒（CS）纳米酶与阿霉素（DOX）共载水凝胶，通过清除活性氧（ROS）抑制NADPH氧化酶活性，降低cleaved caspase-1和N-GSDMD表达，显著抑制NETs形成。该疗法使60%的GBM荷瘤小鼠生存期延长至24个月，且保留基本认知功能，为GBM治疗提供了新型纳米酶调控策略。

　　

胶质母细胞瘤（GBM）作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，即使经过手术切除联合放化疗，患者中位生存期仍仅12-15个月，五年生存率不足5%。这种治疗困境主要源于肿瘤细胞的浸润性生长特性——如同树根般深入正常脑组织，使得手术难以彻底清除，导致术后复发率高达90%以上。更令人困惑的是，手术本身会引发强烈的炎症反应，大量招募中性粒细胞到手术区域，而这些免疫细胞却可能"助纣为虐"，通过形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）这种特殊的网状结构，为残留的肿瘤细胞提供增殖和迁移的温床。

在《Nature Communications》最新发表的研究中，韩耀宝、韩梦晓等研究人员深入揭示了NETs在GBM恶性进展中的关键作用，并创新性地开发了一种多功能纳米酶水凝胶系统，为突破GBM治疗瓶颈提供了新策略。研究发现，手术创伤会诱导神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞大量分泌CXCL1、CXCL2和CXCL15等趋化因子，吸引中性粒细胞在手术腔周围聚集。这些中性粒细胞被激活后，通过NADPH氧化酶产生大量活性氧（ROS），触发组蛋白瓜氨酸化和gasdermin D（GSDMD）蛋白切割，最终形成由DNA骨架和多种水解酶组成的NETs。

令人惊讶的是，这些网状结构并非简单的防御机制，而是成为了肿瘤复发的"帮凶"。体外实验表明，NETs能够使GL261胶质瘤细胞的迁移能力提高5倍，克隆形成能力增强2.4倍。在临床样本分析中，研究人员发现NETs的多少与肿瘤恶性程度正相关——WHO 4级胶质瘤中NETs含量显著高于低级别肿瘤和瘤旁组织，这为NETs作为GBM预后指标提供了临床依据。

为了验证NETs的致病机制，研究团队通过抗体清除中性粒细胞（抗Ly6G）或DNA酶降解NETs（DNase 1）两种策略进行干预。结果显示，抑制NETs形成可使荷瘤小鼠生存期从20天延长至40天，显著延缓肿瘤复发。然而，DNase 1存在稳定性差、易被快速清除的局限性，而中和抗体可能影响机体正常免疫功能，因此迫切需要开发更高效的NETs抑制策略。

研究人员将目光投向了具有多重酶活性的纳米材料。他们巧妙利用κ-硒化卡拉胶作为硒源和稳定剂，通过维生素C还原法制备了尺寸约26纳米的铜硒（CS）纳米酶。该纳米酶表面丰富的HSeO₃基团赋予了其卓越的抗氧化能力，能够模拟超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性，有效清除·OH和·O₂^-等自由基，其EC₅₀值低至1.76μg/mL，抗氧化能力是κ-硒化卡拉胶的112倍。

机制研究表明，CS纳米酶能够作为NADPH氧化酶抑制剂，剂量依赖性地降低中性粒细胞内ROS水平，进而抑制AKT、ERK和p38等信号通路的磷酸化。更重要的是，CS纳米酶显著降低了cleaved caspase-1和N-GSDMD的表达，抑制了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的胞质转位和释放，从而在多个环节阻断NETs的形成。在炎症因子方面，CS纳米酶使脂多糖（LPS）诱导的白细胞介素-6（IL-6）水平从96.7pg/mL降至3.9pg/mL，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因表达下降约6倍，展现出强大的抗炎能力。

在治疗策略上，研究团队设计了局部给药系统——将CS纳米酶与化疗药物阿霉素（DOX）共同装载于Matrigel水凝胶中，在肿瘤切除后立即填充于手术腔。这种设计实现了双重优势：CS纳米酶持续清除ROS抑制NETs形成，改善免疫抑制微环境；同时水凝胶缓释DOX有效杀伤残留肿瘤细胞。值得注意的是，单独使用DOX治疗的小鼠在2个月内死亡率超过70%，而CS纳米酶与DOX联用使87.5%的小鼠生存期达到120天，60%的小鼠无肿瘤生存长达24个月，接近健康小鼠的自然寿命。

安全性评估显示，CS纳米酶主要被中性粒细胞和星形胶质细胞摄取，通过肾脏缓慢代谢，在主要器官中无显著蓄积。虽然治疗初期可见肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）一过性升高，但3周后恢复至正常水平。行为学测试表明，治疗组小鼠在开放场实验、旋转棒测试和莫里斯水迷宫中的表现与健康小鼠无显著差异，空间学习记忆能力保持完整，运动协调性维持在健康小鼠的80%以上，证明该治疗方案具有良好的神经安全性。

关键技术方法包括：通过免疫荧光染色和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者来源胶质瘤组织和小鼠模型中NETs标志物（MPO⁺Cit-histone H3⁺）表达；建立GL261-luciferase原位GBM模型并利用磁共振成像（MRI）和生物发光成像监测肿瘤进展；从小鼠骨髓分离中性粒细胞并通过SYTOX Green染色和Western blot分析NETs形成机制；合成κ-硒化卡拉胶衍生的铜硒纳米酶并表征其抗氧化酶活性；采用水凝胶载药系统进行局部缓释治疗并评估神经行为学功能。

中性粒细胞和NETs促进GBM的恶性肿瘤性

通过比较健康小鼠和荷瘤小鼠脑组织发现，中性粒细胞浸润和NETs形成随肿瘤进展而增加，在大型肿瘤（6mm）中NETs面积占比达15.3%。患者样本分析显示高级别胶质瘤具有更显著的中性粒细胞浸润和NETs形成。手术后手术组小鼠脑内NETs水平显著升高，同时神经元、星形胶质细胞和微胶质细胞分泌的CXCL1、CXCL2和CXCL15等趋化因子介导了中性粒细胞的招募。体外实验证明NETs可促进GL261细胞的迁移和增殖。

抑制NETs可延长GBM荷瘤小鼠术后的生存时间和生存率

通过手术切除肿瘤组织后填充Matrigel，并分别使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞或DNase 1降解NETs，结果显示两种处理均能延缓肿瘤复发，延长小鼠生存期。抗Ly6G组和DNase 1组小鼠生存时间延长至40天，是对照组的两倍。

合成多酶样CS纳米酶以抑制NETs的生成

成功合成κ-硒化卡拉胶衍生的CS纳米酶，其具有优异的ROS清除能力（EC₅₀=1.76μg/mL），可有效抑制LPS诱导的中性粒细胞核解凝和Cit-histone H3表达，且呈浓度依赖性。Western blot和免疫荧光染色证实CS纳米酶能抑制NETs的形成。

CS纳米酶在缓解炎症和抑制NETs形成中的机制

CS纳米酶通过降低细胞内ROS水平和NADPH氧化酶活性，抑制AKT磷酸化，减少TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子释放。同时，CS纳米酶下调cleaved caspase-1和N-GSDMD表达，抑制HMGB1胞质转位，从而阻断NETs形成的关键通路。

CS纳米酶治疗GBM

将CS纳米酶与DOX共载于Matrigel水凝胶中填充手术腔，可显著抑制肿瘤复发。联合治疗组60%的小鼠生存期超过24个月，且神经功能保留良好。Western blot和免疫荧光分析显示CS纳米酶有效降低脑内Cit-histone H3和N-GSDMD水平，减轻神经炎症。

CS纳米酶与DOX的分布和毒性

CS纳米酶在脑内主要被中性粒细胞和星形胶质细胞摄取，通过肾脏代谢排出。血液生化指标显示治疗初期有短暂性改变，但很快恢复至正常水平。行为学测试证实治疗组小鼠认知功能和运动协调性基本保留。

该研究不仅揭示了NETs在GBM术后复发中的关键作用，更重要的是开发了一种通过调控肿瘤免疫微环境的新型治疗策略。CS纳米酶通过清除ROS打破炎症恶性循环，与化疗药物产生协同增效，为神经肿瘤学领域提供了创新性的治疗思路。然而，研究也存在一定局限性：CS纳米酶与中性粒细胞相互作用的具体分子机制仍需深入探索；纳米酶对神经元、星形胶质细胞等脑内其他细胞的影响需要进一步评估；当前研究主要基于GL261模型，在未来需要利用患者来源肿瘤异种移植（PDX）模型等更接近临床的模型进行验证。尽管如此，这项研究为开发针对NETs的靶向疗法奠定了坚实基础，展现了纳米酶在肿瘤免疫调控领域的巨大应用前景。