嘌呤霉素敏感性氨肽酶作为容积调节性阴离子通道的抑制性辅助亚基调控cGAMP运输的结构与功能研究

《Molecular Cell》：Puromycin-sensitive aminopeptidase acts as an inhibitory auxiliary subunit of volume-regulated anion channels and regulates cGAMP transport

本刊推荐：为解决容积调节性阴离子通道(VRAC)的调控机制问题，研究人员开展了嘌呤霉素敏感性氨肽酶(PSA/NPEPPS)与SWELL1(LRRC8A)相互作用的研究。通过冷冻电镜技术解析了SWELL1-PSA复合物结构，发现PSA通过结合SWELL1胞内LRR结构域形成变构抑制。功能实验表明PSA缺失可增强VRAC基础活性，而过表达则抑制通道激活。该研究首次揭示了PSA作为VRAC抑制性辅助亚基的新功能，为调控cGAMP运输和STING信号通路提供了新靶点。

　　

在我们身体的每个细胞中，都存在着一种神奇的通道——容积调节性阴离子通道(volume-regulated anion channel, VRAC)，它就像细胞的"安全阀"，当细胞吸水膨胀时及时打开，让氯离子和有机渗透物流出，防止细胞过度膨胀而破裂。这种由SWELL1(LRRC8A)蛋白组成的六聚体通道，不仅负责维持细胞容积平衡，还承担着运输重要信号分子（如免疫信使cGAMP、神经递质谷氨酸等）的特殊使命。然而，科学界一直存在一个谜团：这个重要通道在静息状态下如何保持关闭？又是如何被精确调控的？

以往研究表明，许多离子通道都有专门的"辅助亚基"来帮助调控其功能，但VRAC是否也存在这样的天然调控因子，一直是个未解之谜。直到最近，约翰斯·霍普金斯大学的研究团队在《Molecular Cell》上发表了一项突破性研究，揭开了这个谜底——他们发现一个看似不相干的酶类蛋白，竟然是VRAC的"天然刹车系统"。

研究人员首先通过蛋白质组学筛选，意外发现嘌呤霉素敏感性氨肽酶(puromycin-sensitive aminopeptidase, PSA)与VRAC的核心亚基SWELL1存在特异性结合。

这一发现令人惊讶，因为PSA原本被认为是主要负责切割肽链N端氨基酸的代谢酶，现在却与离子通道调控联系在一起。通过免疫共沉淀实验，研究人员证实了这种相互作用在天然细胞中确实存在，且不依赖于其他LRRC8家族成员。

为了看清PSA如何与SWELL1"握手"，研究团队采用了冷冻电镜技术，成功解析了SWELL1-PSA复合物的三维结构，分辨率达到3.19埃。

结构显示，三个PSA分子像"夹子"一样夹住一个SWELL1六聚体，每个PSA同时与两个相邻的LRR结构域结合，形成独特的V形结构。特别有趣的是，PSA主要通过其N端结构域与SWELL1的6-9号LRR重复序列紧密结合，而C端结构域则提供辅助性结合。这种结合方式稳定了LRR结构域的二聚体构象，从而抑制了通道的开放。

功能实验的结果更加引人入胜。当研究人员在细胞中过表达PSA时，VRAC电流几乎完全被抑制；相反，当敲除PSA基因后，细胞在静息状态下就出现了显著的VRAC基础活性。

这种调控具有广谱性，无论是细胞肿胀、细胞内离子强度降低，还是炎症介质sphingosine-1-phosphate(S1P)都能被PSA抑制。最重要的是，这种调控完全不依赖于PSA的酶活性——即使使用酶活性抑制剂tosedostat或构建酶活性缺失突变体，PSA对VRAC的抑制作用依然存在。

进一步研究发现，PSA通过降低VRAC对细胞内离子强度的敏感性来精细调控通道活性。

在生理离子强度(150 mM)下，PSA敲除细胞就表现出明显的VRAC活性，而正常细胞需要离子强度降至100 mM以下才会激活。PSA缺失使VRAC的半数有效浓度(EC₅₀)从113 mM降至89 mM，同时显著加快了通道激活动力学。

这项发现的生理意义在免疫信号传导实验中得到了完美体现。cGAMP作为一种重要的免疫信使，需要通过VRAC进入相邻细胞激活STING信号通路。研究人员发现，PSA敲除显著增强了cGAMP的摄取和下游STING-TBK1信号激活，而这种增强效应完全依赖于SWELL1的存在。

相反，PSA过表达则抑制了cGAMP-STING信号通路。这些结果在多种细胞系（Jurkat T细胞、TIME内皮细胞、HeLa细胞）中都得到了一致验证。

研究采用的关键技术方法包括：通过质谱分析和免疫共沉淀鉴定PSA与SWELL1的相互作用；利用冷冻电镜解析复合物三维结构；采用全细胞膜片钳技术记录VRAC电流特性；通过基因敲除和过表达研究功能调控；使用cGAMP摄取实验评估生理意义。

PSA广泛抑制多种刺激触发的VRAC激活

研究人员通过电生理实验发现，PSA过表达能完全抑制由低渗应激和低离子强度激活的VRAC电流，而表面生物素化实验证实这种抑制并非由于通道膜定位改变。PSA的抑制作用具有广谱性，对S1P诱导的VRAC激活同样有效。通过酶活性抑制和点突变实验，研究证实PSA对VRAC的调控不依赖于其氨肽酶活性，而是需要其与SWELL1的物理结合。关键残基E81和E107的突变会完全破坏PSA的抑制功能和结合能力。

PSA缺失增强基础VRAC活性

在PSA敲除的HeLa细胞和Jurkat T细胞中，研究人员观察到显著的基础VRAC电流，这些电流具有典型的VRAC特性：外向整流性和dicumarol敏感性。双敲实验证实这些电流完全依赖于SWELL1。值得注意的是，PSA缺失并不影响VRAC的最大激活程度或离子选择性，但显著改变了通道对离子强度的敏感性。

PSA通过调节VRAC活性调控cGAMP运输

功能实验表明，PSA敲除能增强cGAMP诱导的STING和TBK1磷酸化，而这种效应在SWELL1敲低细胞中消失。相反，PSA过表达抑制cGAMP-STING信号通路。这种调控同样不依赖于PSA的酶活性，而是由其与SWELL1的结合介导。这些结果在多种细胞类型中得到验证，表明PSA通过调节VRAC活性来影响cGAMP运输的普遍性。

研究结论与意义

该研究首次揭示了PSA作为VRAC抑制性辅助亚基的新功能，建立了"LRR结构域构象动态-通道门控"的变构调控模型。PSA通过结合SWELL1胞内LRR结构域，稳定其二聚体构象，从而提高通道激活阈值，防止静息状态下的过度激活。这种调控机制不仅深化了对VRAC门控机制的理解，还为相关疾病的治疗提供了新思路。

特别值得注意的是，该发现与肿瘤化疗耐药性研究形成了有趣的对话。虽然另有一项独立研究发现PSA通过调节VRAC影响顺铂敏感性，但该研究强调酶活性是关键，而本研究则证明结构域相互作用才是主要机制。这种差异可能反映了PSA在不同细胞 context中的多功能性。

这项研究的突破性在于发现了一个普遍存在的代谢酶竟具有离子通道调控的新功能，这种"兼职"现象体现了生物系统的经济性和复杂性。由于PSA在全身各种细胞中均有表达，其对VRAC的调控可能影响多种生理病理过程，包括免疫应答、神经信号传导和药物运输等。未来针对PSA-SWELL1相互作用界面的药物开发，可能为增强抗癌免疫或改善化疗敏感性提供新策略。