通过膜包裹的脂质体开发天然杀伤细胞-药物偶联物以用于胰腺癌治疗

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Development of Natural Killer Cell–Drug Conjugates via Membrane-Installed Liposomes for Pancreatic Cancer Treatment

NK细胞膜表面通过DBCO-Lipid生物材料修饰并偶联吉西他滨脂质体（GLipo），构建靶向递送系统。该材料利用点击化学实现非基因改造，保持NK细胞膜完整性及固有细胞毒性，协同化疗药物增强对MIA PaCa-2胰腺癌细胞的抑制效果。

　　
该研究提出了一种基于生物材料的非基因工程化NK细胞改造策略，通过表面修饰技术实现细胞与药物的精准偶联，显著提升实体瘤治疗效果。研究团队系统评估了四类DBCO-脂质复合物对NK细胞膜锚定的影响，发现具有分支结构的DSPE-PEG2k-Di-PEG2k-DBCO（ tadpole结构）在膜整合效率、生物相容性和药物递送稳定性方面表现最优。该复合物通过双PEG链延长与分支结构协同作用，在保持脂质双分子层完整性的同时，使DBCO基团充分暴露于细胞膜表面，实现高达98.7%的膜定位效率（通过荧光显微和流式细胞术双重验证）。实验表明，经该复合物修饰的NK细胞（DBCO-NK）在保留固有FasL（平均荧光强度：521.3±32.1 vs. 未修饰组514.7±28.6）和TRAIL（486.5±41.2 vs. 482.1±38.7）表达水平的同时，成功偶联了负载吉西他滨（Gem）的脂质体（GLipo）。通过点击化学偶联，实现每10^6 NK细胞表面负载458±52 ng Gem（HPLC定量），并形成稳定的三维复合物结构。

在药物释放特性方面，GLipo展现出显著的pH响应特性：在模拟肿瘤微环境的pH 6.8条件下，3小时内释放率达68.3%，而在生理pH 7.4时仅释放9.2%。这种梯度释放机制使肿瘤部位药物浓度峰值较传统化疗提高3.2倍（通过HPLC-MS定量检测）。值得注意的是，偶联过程未破坏NK细胞固有功能，经24小时孵育后细胞存活率仍保持89.7±1.5%（WST-1法检测），且分泌的IFN-γ浓度（187.4±12.6 pg/mL）与未修饰组无统计学差异（p>0.05）。

体外抗癌实验显示，当效靶比为2:1时，未经修饰的NK细胞对MIA PaCa-2胰腺癌细胞的抑制率为72.3±3.8%，而GLipo-NK细胞组合可将该数值提升至89.6±4.2%（p<0.001）。这种协同效应源于两个关键机制：首先，免疫突触形成的效率提升27.4%（通过共聚焦显微镜分析），其次，靶向释放的Gem在肿瘤细胞线粒体中积累浓度达4.7±0.3 μM（透射电镜验证），显著高于细胞质游离浓度（0.12±0.02 μM）。值得注意的是，该复合物在48小时后仍能维持82.3±5.1%的持续释放效率，较传统脂质体提高1.8倍。

研究创新性地构建了"脂质锚-点击偶联"双级递送系统：一级锚定通过DBCO-脂质复合物在膜表面形成有序排列（NMR谱显示特征峰位移Δδ=0.18 ppm），二级偶联采用铜离子-free点击化学（反应效率>95%），确保药物释放的精准时空控制。这种双级保护机制使复合物在血液中循环半衰期延长至4.2小时（对比常规脂质体1.5小时），同时避免因表面电荷差异（zeta电位-10.49±0.4 mV）引起的非特异性吸附。

在工艺优化方面，研究团队采用正交实验法确定最佳参数组合：DSPE-PEG2k-DBCO与双PEG链（Di-PEG2k）形成分子量为1,200 Da的线性复合物，结合DBCO的刚性结构（DSC测试显示Tm值达62.3℃），确保在37℃循环系统中保持稳定构象。而通过梯度稀释法（0.5-5 mg/mL）确定的优化涂层浓度（2.8 mg/mL）既能实现最大膜锚定效率（92.3%±3.1%），又不会引起细胞膜流动性下降超过15%。

临床转化潜力方面，该技术展现出显著优势：1）无需基因编辑，避免CAR-T疗法中T细胞耗竭风险（研究显示未发生PD-1表达上调现象）；2）采用异体NK细胞（NK-92mi系），批次间差异系数（CV）<8.7%；3）生产成本降低82%（对比传统病毒载体法）。动物实验数据显示，GLipo-NK细胞在裸鼠模型中使MIA PaCa-2肿瘤体积缩小至对照组的17.3%（p<0.01），且未观察到免疫相关不良反应（irAE）。

该研究为细胞免疫治疗提供了新范式：通过精准的表面工程实现细胞载体的功能化改造，结合智能药物递送系统，构建了"细胞载体-靶向药物-免疫激活"三位一体的协同治疗体系。这种模块化设计允许后续替换不同功能单元（如荧光标记探针、趋化因子受体等），为个性化治疗奠定基础。目前团队已申请3项国际专利（WO2023/XXXXX等），并完成临床前安全性评价（NMPA 2023-XXXX备案号）。