基于QIIME2的工作流程，用于多扩增子16S rRNA分析

《Microbiology Resource Announcements》：A QIIME2-based workflow for multi-amplicon 16S rRNA profiling

本研究开发了适用于Ion Torrent测序的QIIME2开源多区16S测序流程，通过模拟社区验证显示其分类准确度（F1分数0.875）与专有软件Ion Reporter相当，且多区方法显著优于单区分析。

　　

摘要

我们介绍了一个开源的QIIME2流程，用于16S多扩增子测序。通过与专有软件在模拟社区数据上的对比测试，我们的工作流程显示出相当的测序深度和分类准确性（F1分数=0.875）。多区域方法优于单扩增子方法，验证了我们的流程是处理基于半导体的测序数据的可靠替代方案。

公告

多扩增子测序可以提高分类分辨率，但目前针对Ion Torrent数据的强大开源工作流程与专有工具的对比测试还不够充分。为了解决这个问题，我们提出了一个基于QIIME2的流程，并使用ZymoBIOMICS微生物群DNA标准（Zymo Research，目录号：D6306）与Ion Reporter（IR）软件进行了对比验证。

从模拟DNA标准中生成了针对六个16S rRNA高变区的扩增子文库（V2；V3；V4；V6-7；V8；V9），并将其浓度标准化为20 ng/μL，使用Thermo Fisher的Ion 16S宏基因组学试剂盒按照制造商的协议（公开编号：MAN0010799）进行操作。文库使用Ion Xpress接头进行索引，然后汇集并在Ion GeneStudio S5平台上进行测序，生成长度为170–350 bp的单端读段。

原始读段分别使用专有的IR（v5.20）宏基因组学16S v1.1流程和我们的自定义QIIME2（v2023.7）流程进行了分析。原始数据首先使用Ion Torrent Suite进行解复用，随后使用Metagenomics PP插件（Thermo Fisher）转换为每个区域的FASTQ文件，该插件会去除条形码和引物。通过DADA2（2）软件进行去噪处理，并使用“-pyro”选项来正确模拟Ion Torrent的错误分布。将得到的区域特异性扩增子序列变异（ASV）表格合并，统计重叠读段的计数，并附上相应的代表性序列。使用SEPP（3）构建了系统发育树。作为主要基准测试，分类结果是与Greengenes v13_5数据库（4）进行比对的。参考数据库是通过提取接近全长的序列为多区域分析准备的，而为单区域分析提取了特定的扩增子，所用引物详细信息见我们的原始研究（5）。然后使用VSEARCH（6）采用了“从局部到全局”的比对策略，将每个短ASV与长参考序列中的最佳匹配片段进行全局比对。最终将QIIME2处理后的结果导入R（v4.2.2）中，使用QIIME2 R包（v0.99.6）创建了一个phyloseq对象（v1.46.0）（7），并通过tax_glom（NArm = TRUE）将其归类到属级别。所有后续的统计分析都在R中完成。

为了验证我们流程的性能，我们使用具有已知组成的模拟社区数据与专有的IR流程进行了直接比较。首先使用FastQC（v0.12.1）对原始数据集进行了分析，发现所有样本的总读段数为180,253个，读段长度范围为50–350 bp。在确定了流程的输出结果后，我们根据已知的模拟组成评估了其分类准确性（表1）。我们的V2-9流程与IR的表现相同，最终F1分数为0.875。两种流程都未能检测到Escherichia，这是Greengenes v13_5数据库的一个已知限制，我们在原始研究中已经提到了这个问题（5）。

流程	区域	ASV数量	真阳性	假阳性	假阴性	灵敏度	精确度	F1分数
IR	IR	不适用	7	1	1	0.875	0.875
QIIME	V2-9	65	7	1	1	0.875	0.875
QIIME	V2	21	7	0	1	0.875	1	0.933
QIIME	V3	14	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V4	8	6	0	2	0.75	1	0.857
QIIME	V6-7	10	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V8	16	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V9	3	1	0	7	0.125	1	0.222

表1 QIIME2和IR流程在模拟社区上的比较性能

流程	区域	ASV数量	真阳性	假阳性	假阴性	灵敏度	精确度	F1分数
IR	IR	不适用	7	1	1	0.875	0.875
QIIME	V2-9	65	7	1	1	0.875	0.875
QIIME	V2	21	7	0	1	0.875	1	0.933
QIIME	V3	14	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V4	8	6	0	2	0.75	1	0.857
QIIME	V6-7	10	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V8	16	5	0	3	0.625	1	0.769
QIIME	V9	3	1	0	7	0.125	1	0.222

^a

指标是在已知组成的ZymoBIOMICS模拟社区基础上，在属级别计算的。真阳性（TP）：正确识别的属；假阳性（FP）：错误识别的属；假阴性（FN）：遗漏的预期属。灵敏度 = TP/(TP+FN)；精确度 = TP/(TP+FP)。F1分数是灵敏度和精确度的调和平均值。

^b

不适用。