多方面的纳米药物增强金属免疫疗法在肝细胞癌治疗中的应用

《Biomaterials》：Multi-faceted nanodrug reinforcing metalloimmunotherapy for hepatocellular carcinoma

肝细胞癌（HCC）免疫治疗受限于肿瘤微环境免疫抑制和PD-L1表达不足。本研究通过Lenvatinib抑制MNK1/eIF4E通路降低PD-L1表达，结合Co2+激活cGAS-STING通路诱导免疫原性细胞死亡（ICD），构建pH响应型纳米颗粒Co+Len@OVA，实现肿瘤靶向递送和血管正常化，协同抗PD-L1治疗显著缩小小鼠HCC瘤体，重塑免疫微环境。

　　

胡永伟|何凯明|张明申|王莉|刘雷|陈德胜|李坤|余浩远|梁志星|李思琪|姜鹏|陈桂华|刘伟|徐彦腾|叶林森|杨洋

中山大学第三附属医院肝外科及肝脏移植中心，中山大学器官移植研究所，广东省器官移植研究中心，广东省移植医学工程实验室，中国广州510630

摘要

肝细胞癌（HCC）由于其免疫抑制性微环境和现有免疫疗法的疗效有限，成为治疗上的重大挑战。虽然免疫检查点抑制剂（ICIs）能提高某些患者的生存率，但其效果受到T细胞浸润不足和肿瘤血管异常的阻碍。为了解决这一问题，我们研究了将乐伐替尼（Lenvatinib）与Co²⁺结合使用的疗效潜力，这种策略旨在同时靶向PD-L1表达并激活抗肿瘤免疫。机制研究表明，乐伐替尼抑制MNK1/eIF4E介导的PD-L1翻译，而Co²⁺可诱导ROS依赖的DNA损伤并激活cGAS-STING通路，从而在HCC细胞中触发免疫原性细胞死亡（ICD）。基于这些发现，我们通过共组装卵白蛋白（Ovalbumin）、乐伐替尼（Lenvatinib）和Co²⁺制备了pH调节的自组装纳米簇（Co+Len@OVA）。这些纳米簇表现出对肿瘤的选择性积累，并增强了血管正常化，促进了抗PD1抗体进入肿瘤。在小鼠HCC模型中，Co+Len@OVA与抗PD1疗法联合使用显著减少了肿瘤体积，效果优于单一疗法。该组合还通过促进树突状细胞（DCs）成熟、增加细胞毒性CD8⁺ T细胞和抑制调节性T细胞（Tregs）浸润，重塑了免疫抑制性微环境。我们的研究建立了一种结合金属免疫疗法与血管调节的组合方法，为无法切除的HCC提供了具有临床转化前景的策略。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，预计到2025年每年病例数将超过一百万例，这凸显了创新疗法的紧迫性[1]。虽然酪氨酸激酶抑制剂（如乐伐替尼）和免疫检查点抑制剂（ICIs）是治疗无法切除的HCC（uHCC）的一线疗法，但其疗效受到免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和PD-L1表达不稳定的影响[2]，[3]。最近的研究表明，将血管正常化与免疫激活策略结合使用可能克服这些限制，但设计协同治疗方案仍然具有挑战性[4]。

乐伐替尼显示出调节PD-L1表达的潜力，PD-L1是一种关键的免疫检查点蛋白，可帮助肿瘤逃避免疫系统[5]。计算方法（如分子对接）已被用于识别针对PD-L1相关途径的药物候选物，进一步支持了乐伐替尼的免疫调节作用[6]。然而，其临床效益受到药物活性短暂和TME重编程不足的限制[7]。为了解决这些问题，金属免疫疗法作为一种利用金属离子调节抗肿瘤免疫的新策略，在重塑免疫抑制性TME方面显示出希望[8]，[9]。例如，钴离子（Co²⁺）通过线粒体DNA释放诱导caspase-1/GSDMD依赖的焦亡，从而增强cGAS-STING信号传导并促进抗原呈递[10]，[11]。同时，钴离子抑制调节性T细胞（Treg）的浸润，使TME向免疫原性状态转变[12]。

具有pH控制组装特性的纳米载体（如基于卵白蛋白的纳米簇）可以利用酸性TME实现肿瘤靶向药物递送[13]，[14]。通过这些平台将乐伐替尼的PD-L1抑制作用与钴的免疫刺激效应结合使用，可以协同增强免疫疗法的效果，同时最小化脱靶毒性。

在这项研究中，我们通过OVA介导的自组装方法制备了Co²⁺-乐伐替尼纳米簇（Co+Len@OVA）。该系统结合了乐伐替尼的免疫检查点调节作用和钴驱动的STING通路激活，以重塑TME。Co+Len@OVA诱导免疫原性细胞死亡（ICD），促进树突状细胞（DC）成熟，并使肿瘤血管正常化，从而提高抗PD1抗体的渗透性。与ICIs联合使用时，这种策略实现了更显著的肿瘤消退，为uHCC的治疗提供了变革性方法（图1）。

计算机辅助药物设计（CADD）驱动的乐伐替尼作为PD-L1抑制剂模拟物eFT508的鉴定

基于已建立的eFT508介导的PD-L1抑制机制[15]，[16]，我们实施了计算药物发现流程来识别具有临床转化潜力的替代品。我们的CADD工作流程（图1A）从使用RDKit基础化学信息学对FDA批准化合物进行结构筛选开始，通过基于知识的评分生成了Top200列表（图1B）。随后进行药物相似性（QED）优先级评估（阈值>0.50）（图1C）和手动

讨论

计算机辅助药物设计（CADD）在将乐伐替尼鉴定为HCC治疗再利用候选物方面的应用，凸显了其在加速药物发现方面的变革潜力。我们的计算模拟显示，乐伐替尼通过与MNK1的ATP结合口袋竞争性结合，从而抑制PD-L1表达，这对于PD-L1表达高且对抗PD1疗法反应不佳的患者来说是一个关键进展[46]。这

结论

本研究展示了一种组合策略，将金属免疫疗法（Co²⁺驱动的STING激活）与乐伐替尼介导的PD-L1抑制和血管正常化相结合。Co+Len@OVA纳米簇平台解决了当前乐伐替尼/抗PD1治疗方案中存在的T细胞浸润不足、免疫抑制性TME以及药物递送不稳定的问题，通过协调先天/适应性免疫激活并增强ICIs的渗透性。这些发现强调了CADD引导的药物再利用方法的重要性

材料

卵白蛋白（Ovalbumin，vac-stova）购自InvivoGen；TUNEL assay（T2195）、抗Ki67（K010075P）和抗CD31（K010054M）购自Solarbio；CoCl₂•6H₂O（C434161）购自Aladdin；氢氧化钠（S817971）、结晶紫（C805210）、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（N808856）和N-羟基琥珀酰亚胺（H6231）购自Macklin；乐伐替尼（S1164）购自Selleck；Cy7 DiC18（DIR）（HY-D1048）、D-荧光素（HY-12591A）和8-OHdG

CRediT作者贡献声明

陈桂华：撰写 – 审稿与编辑，监督。胡永伟：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，验证，方法学研究，调查，数据分析，概念化。姜鹏：调查。李思琪：调查。梁志星：调查。张明申：可视化，调查，数据分析，概念化。刘伟：验证，监督，资源获取，概念化。何凯明：

数据可用性

从RNA测序生成的原始数据已存入基因表达组学数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE286376），访问代码为GSE286376。验证本研究结果所需的数据可在文章、补充信息和源数据文件中完全获取。如需额外数据，可向通讯作者请求，无访问或使用限制。

利益声明

作者声明没有竞争利益。所有作者已充分讨论了结果并一致批准了最终版本。

资助

本工作得到了以下资助：

中国国家重点研发计划，2024YFA1107200；国家自然科学基金，U24A20655（资助杨洋）

国家自然科学基金，82500805；中国博士后科学基金会博士后奖学金计划，GZC20242089（资助胡永伟）

国家自然科学基金，82103448；广东省自然科学基金，2023A1515010322（资助叶林森）

国家自然科学基金，22572223。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢中山大学仪器分析与研究中心的卓文山教授提供的技术支持。