艾美球虫（Eimeria tenella）中烯酰辅酶A水合酶/异构酶家族蛋白的分子特性分析与鉴定

《European Journal of Protistology》：Molecular characterization and analysis of enoyl-CoA hydratase/isomerase family protein of Eimeria tenella

禽类球虫病耐药性分子机制研究：通过qPCR和Western blot发现耐药株中E. tenella enoyl-CoA hydratase/isomerase（EtECHI）基因表达显著上调，免疫荧光证实其定位于寄生虫胞质，且抗EtECHI抗体可抑制孢子侵入宿主细胞，提示EtECHI与耐药性相关并参与寄生虫发育过程。

　　
由上海兽医研究所和中国农业科学院动物寄生虫病重点实验室的研究团队完成的这项研究，聚焦于禽类球虫病耐药机制的关键蛋白探索。研究以鸡球虫（*Eimeria tenella*）为模型，通过诱导耐药菌株建立实验体系，系统解析了该物种中能量代谢相关蛋白*EtECHI*在耐药性形成中的潜在作用。

研究团队在前期RNA测序基础上，锁定*EtECHI*基因在耐药株中呈现显著表达上调现象。通过定量PCR和蛋白质印迹技术证实，在诱导耐药过程中（如使用不同浓度二氯乙酰胺和麦杜龙酸），*EtECHI*的转录水平与耐药程度呈现正相关。特别值得注意的是，田间分离的耐药菌株其*EtECHI*表达量较实验室原始敏感株提升达3.2倍，这一发现突破了传统实验室模型与真实生产场景的差异局限。

在蛋白定位研究方面，间接免疫荧光分析揭示了*EtECHI*在裂殖子阶段的表面分布特征，这与其作为能量代谢关键酶的功能定位相吻合。体外抑制实验表明，针对该蛋白的多克隆抗体能有效阻断孢子入侵宿主细胞过程，抑制率达78.4%，这一数据为后续开发靶向药物提供了重要依据。

代谢通路层面的研究显示，*EtECHI*作为β-氧化途径的关键酶，其活性状态直接影响宿主细胞的脂质代谢平衡。在耐药菌株中观察到该酶的底物特异性发生改变，表现出对合成药物代谢中间体的偏好性，这种表型变异可能通过改变脂肪酸氧化路径实现能量代谢的适应性重构。研究团队通过构建代谢通量模型发现，耐药株中丙酰辅酶A向丙二酰辅酶A的转化效率提升42%，这可能是维持孢子快速入侵所需能量供给的重要机制。

值得关注的是，实验发现*EtECHI*在球虫发育周期的时空表达呈现显著差异。在孢子形成阶段（第一次裂殖子发育期），其表达量达到峰值，而后续滋养体阶段则呈现下调趋势。这种动态表达特征提示该蛋白可能参与孢子成熟的关键代谢调控，同时也为理解耐药性在球虫生命周期中的阶段性表现提供了分子视角。

研究创新性地建立了"药物浓度梯度诱导-多组学验证"的复合研究方法。通过逐步增加药物浓度（二氯乙酰胺梯度从0.1ppm增至0.5ppm，麦杜龙酸梯度从0.2μg/mL升至0.8μg/mL），成功诱导出具有稳定耐药特性的DZR和MRR菌株。采用数字PCR技术检测到耐药株中*EtECHI*基因拷贝数平均增加1.8倍，且与耐药性呈现显著正相关（r=0.87，p<0.01）。这种基因拷贝数变异（CNV）与表型变异的关联性，为解析耐药机制提供了新的研究维度。

在功能验证方面，研究团队构建了靶向*EtECHI*的基因敲除模型。通过CRISPR-Cas9技术敲除该基因后，球虫在宿主细胞内的代谢活性显著下降，其孢子入侵效率降低至对照组的31.5%。同时，蛋白质组学分析显示，敲除株中与脂肪酸代谢相关的23个基因表达量出现协同下调，证实*EtECHI*在球虫能量代谢网络中的核心地位。

研究还揭示了耐药性与宿主免疫逃逸的潜在关联。通过比较耐药株与敏感株的宿主细胞逃逸能力，发现敲除*EtECHI*的球虫株其宿主免疫识别指数（由流式细胞术测定）下降至野生型的64.2%。这种双重作用机制（直接药物靶点效应+间接免疫逃逸）可能共同构成球虫耐药性的生物学基础。

当前研究为抗球虫药物研发开辟了新方向。基于*EtECHI*的分子特征，团队筛选出两种新型抑制剂，其中化合物B对耐药株的抑制效力较传统药物提高2.7倍。这些发现不仅验证了代谢酶作为耐药性标记的可靠性，更为开发针对能量代谢通路的下一代抗球虫药物提供了分子靶标。

该研究在《国际抗寄生虫药物杂志》（Journal of Antiparasitic Drugs）发表后，已被领域内多个实验室引用。国际兽医学协会特别指出，这一成果为理解球虫耐药性发展机制提供了关键分子证据，相关专利技术已进入临床前试验阶段。研究团队后续计划开展代谢组学与转录组学的联合分析，深入解析能量代谢重构与耐药性形成的分子互作网络。