Takara新型可溶性微流体转导技术让CAR-T细胞构建更高效

Takara提供一种基于新型生物支架技术的可溶性T-Cell转导海绵，可让CAR-T细胞构建更高效。这种T细胞转导海绵可以做到一步完成T细胞活化和慢病毒转导两个过程，实现高效活化、高效转导、高细胞活力，具有高实验稳定性和重复性。

肿瘤一直以来都困扰着人类健康。随着肿瘤免疫学理论的深入研究和技术的不断进步，肿瘤免疫治疗有望实现肿瘤的根治性突破、成为肿瘤治疗的主流方法。肿瘤免疫疗法被称为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤疗法，并于2013年被《科学》杂志评为年度最具价值的科学突破之一。肿瘤免疫疗法中，CAR-T细胞疗法备受瞩目，截止到目前为止，国内已上市8款CAR-T产品，全球已上市15款CAR-T产品。

CAR-T细胞疗法的关键环节之一是CAR-T细胞的制备，慢病毒载体是CAR基因基因导入所使用的主要技术路线。CAR-T细胞的制备流程通常可被分为：外周血单核细胞（PBMC）采集，T细胞分离，T细胞激活，T细胞（体外）基因修饰，CAR-T细胞体外扩增，CAR-T细胞质量监控及回输，共6个主要步骤。在一般的技术路线中，T细胞的激活和基因修饰是独立分开的两个过程。Takara Bio可以提供一种新型可溶性微流体转导系统——Lenti-X™ T细胞转导海绵，让CAR-T细胞构建更高效。

基于新型生物支架技术的T-Cell转导海绵

Lenti-X T细胞转导海绵，是一种新型可溶性微流体转导系统。依托于大孔径的海藻酸盐海绵状3D结构，可以做到一步完成T细胞活化和慢病毒转导两个过程，既提高了时效性，又减少了对细胞的处理过程，对转导需要的病毒量也更小，能够实现高效活化、高效转导、高细胞活力，具有高实验稳定性和重复性。

Lenti-X T细胞转导海绵的结构基础，由具有高生物相容性的钙离子交联海藻酸盐制成，融入了经过优化的T细胞活化试剂（重组人白介素2rhIL-2和抗人CD3/CD28抗体）混合物。大孔径的海藻酸盐孔隙结构，孔径范围在20-300 μm之间，无需借助仪器可实现微流体驱动的慢病毒高效转导。当T细胞和病毒进入转导海绵，T细胞活化剂会激活进入的T细胞，大孔3D结构通过共定位T细胞和病毒促进转导来提高转导效率。转导完成后，使用特定缓冲液溶解海绵，转导后的细胞就会被释放出来。

Lenti-X T-Cell转导海绵工作原理

将靶标细胞（T细胞或PBMCs）和慢病毒混合后，添加到T细胞转导海绵中，37°C孵育1小时，以使混合物被充分吸收。吸收完全后，加入细胞培养基，37°C孵育48小时。

孵育完成后，加入专用的释放缓冲液浸泡海绵，转导后的细胞就可以轻松从海绵中释放出来。在随后的洗涤步骤中，完成转导的海绵会被溶解，而这不会对细胞活力造成影响。这些细胞可以扩大培养或者用于下游研究应用。整个操作过程减少了对细胞的处理步骤，降低了对病毒的需求量，总反应体积也更小，对用户非常友好。使用T细胞转导海绵，可以获得与传统方法相当或优于传统方法的转导效率，并且更容易获得高度一致的实验结果，实验稳定性和重复性高。

案例分享1——高效活化人原代T细胞

不同MOI情况下高效活化T细胞。

将表达绿色荧光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染复数（MOI=0，5，10，Average）和4 × 10⁶人原代T细胞进行混合，分别添加至Lenti-X T细胞转导海绵（" T-cell sponge "）进行活化，同时也使用CD3/CD28 Immunocult T细胞激活剂（"Conjugate"）活化T细胞作为平行比较。未经激活处理的细胞作为阴性对照（"Unstim"）。48小时后，通过流式细胞荧光分选技术（FACS）分析检测活化T细胞中CD69的表达情况。在本案例中，T细胞转导海绵实验组CD69阳性率要高于Conjugate实验组。

案例分享2——高效转导人原代T细胞

不同MOI情况下高效转导人原代T细胞。

将表达绿色荧光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染复数（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T细胞进行混合，分别添加至Lenti-X T细胞转导海绵（" T-cell sponge "）进行转导。Spinoculated样品使用CD3/CD28 Immunocult T细胞激活剂活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作为转导增强剂同时1,500 g离心90分钟促进慢病毒转导（"Spinoculation"）。通过流式细胞荧光分选技术（FACS）分析指定时间点绿色荧光蛋白（GFP）ZsGreen1的表达情况来评估转导效率。图中显示的百分比是转导七天时GFP+的表达情况。在本实验例中，T细胞转导海绵实验组GFP+阳性率均高于Spinoculation方案实验组。

案例分享3——转导后依然保持高细胞活力

转导后人原代T细胞依然保持高细胞活力。

将表达绿色荧光蛋白ZsGreen1的慢病毒以不同感染复数（MOI=0，5，10）和4 × 10⁶人原代T细胞进行混合，分别添加至Lenti-X T细胞转导海绵（" T-cell sponge "）进行转导。Spinoculated样品使用CD3/CD28 Immunocult T细胞激活剂活化2天，之后添加polybrene (8 µg/ml)作为转导增强剂同时1,500 g离心90分钟促进慢病毒转导（"Spinoculation"）。转导后通过7-AAD染色法和流式细胞荧光分选技术（FACS）在指定时间点对细胞活力进行分析。在本实验例中，T细胞转导海绵实验组依然保持较高的细胞活力，与Spinoculation方案实验组水平相当或者略高。

除了专用于T细胞的转导海绵，Takara Bio还可以提供适用范围广谱的通用型转导海绵，可用于转导人原代T细胞、CD34+造血干细胞、自然杀伤细胞、悬浮和贴壁细胞系等细胞类型，使用广谱不局限，可塑性更强。Takara Bio作为重要的生物技术企业，在病毒基因导入系统方面体系完备，拥有慢病毒系统、逆转录病毒系统、腺相关病毒系统、腺病毒全套解决方案，为相关生物学基础研究提供强力支持，为寄予厚望的细胞与基因治疗研究护航加码。

创新驱动梦想前行，技术创新，Takara Bio一直在路上。

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