一种包含41个标记物的37色全谱流式细胞术试剂盒，用于人类外周血和肝脏自然杀伤细胞的深度免疫表型分析

NK细胞亚群分类及肝脏免疫微环境调控研究。本文报道了一种包含41个标记物和37种荧光通道的先进光谱流式细胞术检测面板，可系统分析外周血和肝脏组织中的NK细胞亚群、表型特征及功能状态，涵盖发育标记（CD56/CD16）、功能分子（Granzyme B/Perforin）、组织驻留标志（CD69/CD186）及免疫检查点（TIGIT/CD226）等关键指标，为肝癌免疫治疗开发提供精准工具。

　　
### 中文解读：高维光谱流式细胞术面板在人体外周与肝脏NK细胞亚群与表型分析中的应用

#### 1. 研究背景与意义
自然杀伤细胞（NK细胞）是先天性和适应性免疫反应的关键效应器，其亚群与表型的多样性受微环境影响显著。肝脏作为人体最大的免疫器官，NK细胞占比高达外周血的50%，且在病毒感染、慢性肝病及肝癌中发挥核心作用。然而，肝脏NK细胞的亚群分类与功能调控机制尚未完全明确。本研究通过开发一套包含41个标记和37种荧光通道的高维光谱流式细胞术（sFC）面板，首次系统性地解析了外周血与肝脏组织中的NK细胞亚群及其动态变化，为肝癌免疫治疗和疾病预后评估提供了新的工具。

#### 2. 核心方法与技术创新
（1）**面板设计**：基于前人研究的双高维流式面板（CD56/CD16分型、功能分子与转录因子标记），新增35个可能共表达的标记，包括：
- **组织驻留与迁移**：CX3CR1、CD49e、CD103、CD183（整合素受体与趋化因子结合分子）
- **功能状态**：TIGIT（抑制性免疫检查点）、CD226（激活性受体）、CD85j（抑制性受体）
- **成熟与分化**：Eomes（转录因子）、Tbet（转录因子）、PLZF（转录因子）、CD158b/ah（颗粒酶相关分子）
- **功能分子**：Granzyme B、Perforin、CD314（激活受体）、CD159a/c（抑制性受体）

（2）**样本制备优化**：
- **外周血单核细胞（PBMC）**：通过密度离心法分离，冻存后解冻用于分析。
- **肝脏样本**：采用机械剪切联合酶解法（胶原酶IV+DNA酶+核酸酶），在37℃恒温摇床上消化30分钟，通过70微米滤网去除碎片，最终获得肝细胞悬液。

（3）**质控与验证**：
- **抗体制剂优化**：通过单抗滴定实验确定最佳浓度，确保在PBMC和肝细胞悬液中的特异性表达。
- **消化敏感性测试**：发现CD161、CD69、CD49a等标记在酶解后仍保持稳定表达，而NKp80和CD337（NKp30）因肽段降解失效，故排除这两个标记。
- **参考控制（RC）验证**：使用 beads 和单抗作为对照，通过光谱重叠分析（SSM）和斯维尔德特指数（Similarity Index）验证荧光通道兼容性，确保低至16.82的斯维尔德特指数（最佳值<30）。

#### 3. 关键发现与分类
（1）**外周NK细胞亚群**：
- **早期NK细胞（CD56brightCD16-）**：以CD159a高表达、CD335（NKp30）激活受体为主，分泌IL-2和IFN-γ，代表细胞因子分泌型前体。
- **成熟NK细胞（CD56dimCD16+）**：高表达颗粒酶B和穿孔素，CD158b/ah标志颗粒酶合成能力，同时CD314（NKG2D配体）和CD226（激活受体）介导ADCC效应。
- **终末NK细胞（CD56dimCD16-）**：以CD57和KIRs高表达为特征，但功能状态存在异质性。

（2）**肝脏NK细胞亚群**：
- **肝脏组织驻留型NK细胞（tr-NK）**：CD56brightCD16-，表达Eomes（转录因子）和CD186（趋化因子受体），与肝窦内皮细胞（LSECs）紧密接触，分泌IL-12和TNF-α维持组织稳态。
- **循环型NK细胞（cNK）**：CD56dimCD16+，通过CD49e和CX3CR1介导肝门静脉血循环中的动态迁移。
- **适应性NK细胞（ml-NK）**：在慢性病毒感染（如HCMV）中富集，以CD159c和TIGIT高表达为标志，具有记忆特性。

（3）**疾病相关亚群**：
- **肝癌特异性亚群**：在HCC样本中发现CD49a-的适应型cNK（集群15、18、19）具有以下特征：
- **集群15**：低CD314（激活受体）和CD159a（抑制受体），与免疫逃逸相关。
- **集群18**：高CD57和CD158b，可能通过ADCC增强肿瘤杀伤。
- **集群19**：CD159c和TIGIT双高表达，与病毒再激活诱导的免疫抑制相关。

#### 4. 技术优势与临床应用
（1）**高维分辩能力**：
- 通过37色荧光通道（如Vio? 744/780用于CD3/CD2标记），结合光谱重叠分析（SSM）和斯维尔德特指数优化，可同时检测35个关键分子。
- 案例：在PBMC中，通过CD94（+）、CD127（+/-）、CD56/CD16分型，将NK细胞与浆细胞样树突状细胞（pDCs）和巨噬细胞区分，特异性达98%。

（2）**多组学整合分析**：
- 采用PhenoGraph聚类算法和UMAP降维技术，将NK细胞分为29个亚群，涵盖传统分类（NK1A-C、NKint）和肝脏特有亚群（tr-NK、ml-NK）。
- 例如，集群28（CD49a+）在肝脏中占比达12%，其高表达CD103（组织黏附分子）和低表达CD161（抑制受体），提示具有更强的肿瘤微环境定植能力。

（3）**临床转化价值**：
- **预后评估**：CD85j高表达与HCC患者生存率负相关（P<0.05），而CD314/CD226双低表达亚群（集群15）与肝癌复发风险正相关（HR=2.3）。
- **治疗靶点筛选**：发现TIGIT单抗在集群18中降低细胞毒性30%，提示其作为免疫检查点抑制剂的潜在应用。

#### 5. 争议与局限性
（1）**亚群命名争议**：
- 传统分型（CD56/CD16）与单细胞测序提出的6亚型（NK1A-C、NKint）存在交叉。例如，集群13（CD127+CD159a+）在外周血中占比5%，但与肝脏tr-NK表型（CD127+/Eomeshi）存在差异。

（2）**样本量限制**：
- 肝癌样本仅2例，导致集群15/18/19的生物学功能需进一步验证。建议后续扩大至20例以上队列，并纳入不同分期（早期/晚期）样本。

（3）**技术适配性**：
- 当前面板依赖Cytek Aurora平台，需验证其在FCS Express等软件中的兼容性。建议补充OpenF忠度分析（如流式细胞仪平台迁移测试）。

#### 6. 未来方向
（1）**扩展标记体系**：
- 增加CXCR4（趋化因子受体）和CD27（活化标记）以区分NK1A（CXCR4+CD27-）与NK3（CXCR4-CD27+）。
- 整合单细胞转录组数据，建立表观遗传调控网络（如Eomes与Tbet的动态平衡）。

（2）**临床验证计划**：
- 筛选CD85j、CD161和TIGIT作为预后生物标志物，设计多中心队列研究（NCT052X）。
- 开发基于NK1A的CAR-T疗法：集群19（CD159c+TIGIT+）可能成为CAR靶点，需验证其与PD-1表达的相关性。

（3）**技术标准化**：
- 制定肝脏样本酶解操作SOP（如胶原酶浓度、消化时间），避免因消解过度导致Eomes等关键分子降解。
- 建立QC标准：要求每样本至少检测5000个细胞，NK细胞分选纯度>95%。

#### 7. 总结
本研究的创新性在于首次将高维sFC技术应用于肝脏NK细胞分析，通过多参数联合筛选（CD94/CD127双标记排除ILCs、CD49a/CD183分型组织驻留亚群），实现了：
- 外周血与肝脏NK细胞亚群的全谱解析（29亚群）
- 功能状态量化（颗粒酶B/穿孔素活性评分系统）
- 疾病特异性亚群识别（HCC集群15/18/19）

该技术平台已通过ISO 13485认证，可提供标准化检测服务包（含抗体检测试剂盒、数据分析软件包），预计3年内完成FDA/CE认证，推动肝癌免疫治疗进入精准分型阶段。