《Frontiers in Immunology》：Human macrophages release exosomes containing anti-inflammatory microRNAs after phagocytosis of Leishmania infantum
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引言：原生动物寄生虫婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)可引起内脏利什曼病(visceral leishmaniasis, VL)，该疾病与全身先天及适应性免疫应答受抑相关。全身性免疫抑制的潜在机制尚未完全阐明。外泌体(exosomes)是
引言：原生动物寄生虫婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)可引起内脏利什曼病(visceral leishmaniasis, VL)，该疾病与全身先天及适应性免疫应答受抑相关。全身性免疫抑制的潜在机制尚未完全阐明。外泌体(exosomes)是真核细胞释放的一类微泡亚群，内含蛋白质、脂质及包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)在内的核酸。这些小型调节性RNA可同时修饰多条基因及通路的表达。研究人员假设，婴儿利什曼原虫感染巨噬细胞会诱导其释放含有免疫调节性miRNAs的外泌体，从而参与内脏利什曼病期间的全身性免疫抑制。方法：研究人员利用NanoString阵列分析了感染与未感染人巨噬细胞所释放外泌体中的miRNA谱；通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证差异表达，并通过转染miR-mimics（miRNA模拟物）检测功能效应。结果：若干miRNA在感染来源的外泌体中表达上调，其中包括具有抗炎活性的hsa-miR-223-3p。既往研究表明NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)通路可能是差异表达miRNA的靶向对象，该假说在过表达hsa-miR-223-3p的转染THP-1单核细胞系中得到证实。讨论：研究人员表明，婴儿利什曼原虫感染诱导释放含有miRNA的外泌体，这些外泌体能够改变宿主免疫环境，可能通过抑制杀菌通路而有利于寄生虫存活。
论文解读：《Human macrophages release exosomes containing anti-inflammatory microRNAs after phagocytosis of Leishmania infantum》
研究背景与意义
内脏利什曼病（Visceral Leishmaniasis, VL）是一种由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的慢性系统性寄生虫感染，在临床东半球主要由该虫种或杜氏利什曼原虫（L. donovani）导致。VL的典型特征包括发热、消瘦、肝脾肿大以及严重的全身免疫抑制，表现为适应性T细胞应答失败及继发性细菌感染致死率高。尽管已知弥散性寄生虫长期驻留在网状内皮系统（如脾脏、肝脏）的组织驻留巨噬细胞（tissue-resident macrophages）内，但其导致广泛性免疫抑制的具体细胞与分子机制尚不完全清楚。外泌体（Exosomes）作为大多数真核细胞通过多泡体腔内出芽释放的细胞外微泡（Extracellular Microvesicles, EVs）亚群，携带核酸（microRNA、mRNA、DNA）、脂质及蛋白质（细胞因子、表面受体、蛋白酶），可通过血液循环远距离传递免疫调节分子而不依赖直接接触。微小RNA（microRNAs, miRNAs）作为内源性18–25 nt非编码RNA，通过其种子序列（seed sequence）与靶mRNA互补配对抑制翻译或促进降解，具备广泛调控免疫反应基因的潜力。鉴于VL伴随全身性宿主应答抑制且外泌体miRNA经血流广泛分布，研究人员假设婴儿利什曼原虫感染会改变人巨噬细胞释放的外泌体中miRNA组成，进而重塑感染期间的免疫应答环境。该研究旨在揭示这一细胞机制对内脏利什曼病免疫景观的贡献，论文发表于《Frontiers in Immunology》。
主要关键技术方法
研究人员从爱荷华大学DeGowin献血中心的六名健康献血者的白细胞减量过滤锥（Leukocyte Reduction System, LRS cones）中分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs），经贴壁培养获得人单核细胞来源巨噬细胞（Monocyte-Derived Macrophages, MDMs）。使用巴西株婴儿利什曼原虫（MHOM/BR/00/1669）静止期前鞭毛体经人血清调理后感染MDMs，同步化感染四天后收集上清。外泌体经0.22 μm过滤、10 kDa超滤浓缩及110,000 x g超速离心分离，通过纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）表征纯度与粒径。外泌体RNA采用TRIzol法提取并经DNase处理，利用NanoString nCounter Human V3 miRNA面板（检测827种人miRNA）进行表达谱筛查，数据归一化至表达量前100的miRNA。差异表达经RT-qPCR（TaqMan探针法，以内参hsa-miR-16-5p归一化，2-ΔΔCT法计算）验证。生物信息学预测靶基因使用miRDB与TargetScan，通路分析采用PANTHER分类系统。功能验证采用Lipofectamine? RNAiMAX转染miR-mimics（hsa-miR-223-3p模拟物及阴性对照scramble）至THP-1人单核细胞系，经佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）诱导分化后感染寄生虫，24小时收样检测NLRP3表达。统计采用GraphPad Prism进行配对t检验、双因素方差分析（two-way ANOVA）及Dunn多重比较检验。
研究结果
3.1 L infantum感染增加释放的外泌体数量
研究人员对六名健康供体的MDMs感染与未感染组释放的EVs进行NTA分析，结果显示绝大多数EVs符合外泌体尺寸均一性（约100 nm）。感染组与未感染组释放的外泌体粒径无显著差异，但感染MDMs释放的外泌体总数显著增加（p=0.0279），以个体内感染相对于未感染的释放倍数变化亦显著增加（p=0.0287），表明婴儿利什曼原虫感染本身促进了巨噬细胞外泌体的分泌量。
3.2 感染与未感染细胞的外泌体含有不同的miRNA谱
NanoString筛查827种人miRNA后发现155种在任一组别中表达（阈值>20计数）。经多重检验校正，八种miRNA在感染与未感染MDM外泌体中差异显著：hsa-miR-223-3p、hsa-miR-575、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-630在感染组上调；hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-1305、hsa-miR-320e下调。选取差异最显著的五种（hsa-miR-223-3p、hsa-miR-575、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-1305）进行RT-qPCR验证，其中hsa-miR-223-3p（p=0.0271）在感染外泌体中显著上调，hsa-miR-1285-5p（p=0.0082）显著下调；hsa-miR-575与hsa-miR-23a-3p无显著差异，hsa-miR-1305低于检测限。
3.3 靶基因预测与通路分析
针对验证显著的hsa-miR-223-3p（上调）与hsa-miR-1285-5p（下调），联合miRDB与TargetScan预测得228个候选靶基因。PANTHER通路分析显示两者共同富集于“趋化因子与细胞因子信号介导的炎症（Inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling, P00031）”、“促性腺激素释放激素受体通路（Gonadotropin-releasing hormone receptor pathway, P06664）”及“Wnt信号通路（Wnt signaling pathway, P00057）”。因两miRNA表达趋势相反，对同一通路可能产生拮抗调控，仅在炎症介导通路中共享两个预测靶基因PKCS1与SOCS5，故研究人员认为需分别验证单个miRNA的靶标。
3.4 hsa-miR-223-3p转染细胞导致NLRP3基因表达改变
鉴于hsa-miR-223-3p具抗炎活性且可靶向NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）通路，研究人员将hsa-miR-223-3p mimic转染THP-1细胞并诱导分化为巨噬细胞样细胞后感染寄生虫。RT-qPCR显示转染组细胞内hsa-miR-223-3p表达显著高于scramble对照组；在感染条件下，转染hsa-miR-223-3p mimic的细胞NLRP3 mRNA表达显著低于scramble对照组（p=0.041），而未感染组中两者无差异。表明hsa-miR-223-3p能特异性下调寄生虫诱导的NLRP3表达，而不影响基础表达。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，VL伴随进行性全身适应性免疫抑制，本研究假设并证实了感染MDMs释放的外泌体miRNA谱不同于未感染细胞，且感染促使外泌体释放量增加、尺寸无变。显著上调的hsa-miR-223-3p是髓系特异性miRNA，既往报道可抑制中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞炎性应答并靶向NLRP3炎症小体。本研究在人间源细胞中进一步证实过表达hsa-miR-223-3p削弱寄生虫诱导的NLRP3表达，可能通过抑制炎症小体活化利于寄生虫在组织驻留巨噬细胞内存活，并促成VL全身性免疫抑制状态。该发现与研究人员既往在印度VL患者血浆外泌体中hsa-miR-223-3p升高的观察一致。尽管单个miRNA对转录本影响细微，但其可协同调控整条通路；除NLRP3外，hsa-miR-223-3p还可能更广地作用于炎症小体与炎症反应。目前NLRP3在皮肤与内脏利什曼病中的保护或致病角色尚有争议，本研究更支持NLRP3对抗婴儿利什曼原虫感染的保护作用。研究提出，虽单独抑制人miRNA难以作为寄生虫病的特异充足疗法，但针对促成利什曼病致病免疫应答的hsa-miR-223-3p等miRNA抑制剂，或可与抗寄生虫药物联用以应对耐药与有限的治疗选择。这些发现不仅对VL免疫病理机制有启示，也为潜在治疗策略提供了新方向。
结论翻译
内脏利什曼病（VL）是由细胞内原生动物婴儿利什曼原虫在世界多地引起的潜在致死性感染结局。感染虽常无症状，但症状性VL伴随进行性全身适应性免疫应答抑制。本研究基于如下假设：婴儿利什曼原虫感染的巨噬细胞释放的外泌体含有影响免疫景观的miRNAs，且不同于未感染巨噬细胞释放的外泌体中的miRNAs。为探究该假设，研究人员鉴定了感染婴儿利什曼原虫与未感染的人巨噬细胞所释放的miRNA谱，MDMs源自无血缘关系的健康人献血者。利用NanoString人miRNA面板，研究人员观察到婴儿利什曼原虫感染使MDMs释放的外泌体数量显著高于未感染MDMs，但尺寸相似。此外，感染MDMs外泌体的miRNA谱表现为若干较未感染巨噬细胞释放外泌体显著上调或下调的miRNA；值得注意的是，感染MDMs释放外泌体中hsa-miR-223-3p含量显著升高，而hsa-mi-223-3p参与许多感染与炎症条件的调控。既往已显示下调hsa-miR-223-3p会增加巨噬细胞中IL-1β与IL-6的表达。为进一步探究人巨噬细胞中miR-223-3p增加的影响，研究人员将人THP-1细胞系诱导分化为具巨噬细胞样特征，并利用miR-mimic实验性提升细胞内hsa-miR-223-3p，结果在过表达hsa-miR-223-3p的感染巨噬细胞中NLRP3显著降低。研究人员假设NLRP3的下调会抑制炎症小体活化，并可能增强寄生虫在组织驻留巨噬细胞内的存活与生长。本研究中人外泌体最显著的发现是hsa-miR-223-3p的增加。已有先例表明人或鼠miR-223-3p对巨噬细胞功能的影响：鼠间充质干细胞释放的外泌体通过包裹的鼠miR-223-3p促使邻近巨噬细胞向“M2”表型偏移并促进皮肤伤口愈合；人原代骨间充质干细胞释放的外泌体也抑制LPS刺激的THP-1细胞炎性细胞因子表达。人源或鼠源miR-223-3p是髓系特异性miRNA，已被证明可将巨噬细胞偏斜至抗炎表型，且已知调控对启动促炎应答重要的NF-κB通路（该通路有助于控制利什曼原虫感染）。与本研究在人细胞的观察一致，miR-223-3p已被证明在鼠及人系统中靶向负调控NLRP3炎症小体表达。关于NLRP3活化在利什曼病小鼠模型中的保护与致病作用均有报道：人皮肤利什曼病变中NLRP3被活化，而鼠巨噬细胞研究发现杜氏利什曼原虫抑制NLRP3以防御胞内杀伤；本研究结果更符合NLRP3对婴儿利什曼原虫感染巨噬细胞具保护作用，其在皮肤与内脏利什曼病中的角色差异尚待解决。本研究选定单一转录本并显示其受单一miRNA修饰，但miRNA常对单个转录本有细微影响而通过对通路上多个mRNA靶向产生主要效应，且上调miRNA可协同贡献于整体通路调制，miR-223对炎症小体与炎症反应的影响可能较本文记载更为广泛。研究人员既往在印度VL患者队列中发现循环血浆外泌体中hsa-miR-223-3p较流行区对照升高，与本研究中婴儿利什曼原虫感染MDMs致外泌体关联hsa-miR-223-3p增加一致。本研究提供证据表明巨噬细胞过表达hsa-miR-223-3p减弱寄生虫诱导的NLRP3表达，该效应不仅利于寄生虫在脾肝组织驻留巨噬细胞内存活，也可能促成VL整体免疫抑制状态。miRNA抑制剂作为感染病与肿瘤潜在安全有效疗法的研究正在进行；虽单一人miRNA抑制剂难以成为寄生虫病特异充分疗法，但抑制促成利什曼病致病免疫应答的miRNA（如hsa-miR-223-3p）或可对抗寄生虫疗法产生协同获益；在治疗选择有限及寄生虫耐药背景下，miRNA抑制剂联合治疗或具价值。上述发现不仅对免疫病理有意义，也可能为该病治疗策略提供新途径。
