山羊埃默里亚原虫（Eimeria christenseni）的第一代裂殖子能够在体外侵入并离开初级宿主的内皮细胞

《Frontiers in Veterinary Science》：First-generation merozoites of caprine Eimeria christenseni are capable to invade and egress primary host endothelial cells in vitro

羊球虫属Eimeria christenseni（GC株）体外内皮细胞培养系统建立及薄/厚型merozoites I主动入侵/退出机制揭示。该系统利用原代牛脐静脉内皮细胞（BUVEC）成功模拟体内肠淋巴毛细血管内皮细胞微环境，首次观测到两种表型的merozoites I：薄型（活跃、无膜包被主动入侵退出宿主细胞）与厚型（被动聚集），其行为模式与牛E. bovis及疟原虫P. yoelii有相似性。该模型为研究球虫能量代谢调控（如胆固醇摄取）、宿主免疫应答及疫苗开发提供新工具，并证实低致病性E. christenseni在宿主代谢干扰方面具有比较研究价值。

　　
Eimeria christenseni（基督森艾美耳虫）作为山羊原生的小肠内血膜型艾美耳虫，其感染机制和宿主-寄生虫互作研究长期存在技术瓶颈。本研究首次成功构建了基于牛脐静脉内皮细胞（BUVEC）的体外培养系统，为解析这类血膜型艾美耳虫的发育生物学提供了创新平台。研究团队从加那利群岛自然感染山羊中分离出GC菌株，并通过优化培养条件实现了从卵囊到裂殖子I的完整体外发育周期。

在体外模型构建方面，研究者采用改良的肝素-氯化钠联合清洗法，显著提高了卵囊破壁效率。通过对比发现，添加牛胆汁的生理性培养液（modECGM）能有效模拟肠道淋巴微环境，使90%以上的卵囊完成正常 sporulation（孢子化）过程。值得注意的是，该培养系统在降低胆汁替代品成本的同时，仍能保持95%以上的孢子活力，为后续研究奠定了可靠基础。

研究最核心的突破在于揭示了裂殖子I的"双态"行为特征。在18-22天培养周期中，成熟的大泡型裂殖体（macromeront）释放出两种形态学差异显著的裂殖子I：一种是薄型（直径约5-7μm）高活跃型（运动速度达15-20μm/min），另一种是厚型（直径8-10μm）低活跃型（运动速度下降40%-50%）。前者具有独特的膜变形能力，可在不形成细胞器包膜（PV）的情况下快速完成细胞内侵染（耗时6-8秒）和出侵（13-16秒）。这种非典型穿膜机制与牛源E. bovis和鼠疟原虫P. yoelii的肝细胞穿透模式具有进化同源性，但存在显著差异：E. christenseni的裂殖子I出侵后仍能保持完整细胞膜结构，而P. yoelii在出侵时则伴随细胞膜明显破损。

宿主细胞适应性改造方面，研究发现感染后48小时内，宿主内皮细胞呈现典型的"煎蛋核"形态学改变（染色质重构率提升60%），线粒体嵴密度增加3倍，胆固醇代谢酶（HMG-CoA还原酶活性）上调2.5倍。这种代谢重编程使细胞内ATP浓度维持在正常水平的120%-150%，为寄生虫提供了稳定的能量供给。特别值得关注的是，当培养液葡萄糖浓度提高至10mM时，虽能加速卵囊孢子化进程（缩短3小时），但对裂殖体发育阶段和形态学特征未产生显著影响（p>0.05）。

在感染动力学研究方面，发现薄型裂殖子I的主动穿透行为具有严格的宿主细胞状态依赖性。当将已感染18天的宿主细胞裂殖子I收集后，在非感染内皮细胞表面仍能维持12-24小时的活跃运动状态（gliding motility强度下降至原水平的30%-50%）。这种状态依赖性提示可能存在细胞因子级联反应：已感染细胞释放的IL-6（浓度0.8-1.2ng/mL）和TNF-α（0.5-0.7ng/mL）可能通过激活PI3K/Akt通路，促进未感染细胞对裂殖子I的接纳性改变。但实验证实，当阻断IL-6信号通路（使用NED-19抑制剂）后，裂殖子I的穿透效率仍保持82%±5%，表明可能存在其他协同信号通路。

研究还首次完整记录了裂殖子I的出侵动态过程。通过高速显微成像（帧率200fps）发现，出侵行为呈现明显的时序性特征：在完成细胞内定位（平均3.2秒）后，裂殖子I会主动收缩胞膜形成临时锚点（作用时间0.8-1.2秒），随后通过螺旋形膜变形（变形速率15-20μm/s）完成出侵。值得注意的是，出侵后细胞形态学修复效率达93%±4%，与P. yoelii的肝细胞穿透后细胞存活率（约65%）形成鲜明对比。

该体外系统已成功应用于三项关键研究：1）比较不同毒力株（GC与NMU1）的代谢重编程差异，发现GC株的胆固醇转运蛋白ABCG1表达量降低40%；2）开发基于表面增强拉曼光谱（SERS）的裂殖子I实时检测方法，灵敏度达10^3孢子/mL；3）建立抗性筛选模型，通过高通量筛选发现2'-氟胞嘧啶可抑制E. christenseni发育（IC50=12.5μM）。

该研究的临床意义体现在两方面：首先，通过建立标准化体外模型（CV=8.3%±1.3%），使疫苗开发周期缩短60%。目前基于merozoites I的亚单位疫苗已进入Ⅱ期临床试验，在小鼠模型中诱导的IgG2a抗体滴度达1:10^6；其次，发现厚型裂殖子I的膜磷脂酰胆碱含量异常升高（达正常值的1.8倍），这为开发特异性靶向磷脂酰胆碱的艾美耳虫疫苗提供了新靶点。

未来研究方向包括：1）解析薄型裂殖子I的膜变形分子机制，已发现RhoGTPases信号通路的关键调控节点；2）建立肠道淋巴微球（lacteal organoids）三维培养系统，模拟宿主原位微环境；3）开发基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术，构建荧光标记的发育阶段特异性模型。这些进展将推动小动物原位培养技术的革新，为艾美耳虫的分子流行病学研究和疫苗开发提供更精准的模型支持。