木霉分离株的蛋白酶和几丁质酶活性及其与生物炭的协同作用在增强鹰嘴豆防御相关酶方面的效果

《Frontiers in Microbiology》：Protease and chitinase activity of Trichoderma isolates and their synergy with biochar in enhancing chickpea defense related enzymes

Soil-borne pathogens like Fusarium oxysporum and Sclerotium rolfsii threaten chickpea production. This study screened 21 Trichoderma isolates for protease and chitinase activities, identifying four potent strains (e.g., T. harzianum PBT13).温室及田间试验 showed combining PBT13 with biochar reduced disease incidence by 95.95–97.10%, enhanced defense enzymes (CAT, POD, PAL), improved germination, chlorophyll content, and Trichoderma survival. This integrated approach offers a sustainable alternative to chemical fungicides.

　　
近年来，土壤传播真菌病害对 chickpea（鹰嘴豆）生产的威胁日益严重。研究表明，一种名为 *Trichoderma* 的土壤真菌可通过分泌多种胞壁降解酶（如蛋白酶、几丁质酶）直接破坏病原菌细胞结构，同时与有机改良剂协同作用激活植物自身防御系统。该研究以印度旁遮普邦和哈里亚纳邦的土壤样本为研究对象，筛选出4株高效拮抗菌株，并评估其与稻壳生物炭（biochar）的协同效应。

### 研究背景与意义
土壤传播真菌如 *Sclerotium rolfsii*（引起 collar rot）和 *Fusarium oxysporum* f. sp. ciceri（导致黄萎病）占作物损失的50%-60%，且因形成耐逆休眠体（如菌核、厚垣孢子）难以彻底清除。传统化学杀菌剂存在耐药性、环境污染等问题，而生物防治因其环保性和可持续性成为研究热点。 *Trichoderma* 属真菌因其广谱拮抗性和代谢多样性备受关注，但不同菌株的酶活性差异显著，且与有机改良剂的协同机制尚不明确。

### 研究方法与核心发现
1. **菌株筛选与酶活性分析**
从印度旁遮普、哈里亚纳邦和查谟-克什米尔等地的土壤中分离出21株 *Trichoderma*，通过形态学及分子生物学（ITS测序、全基因组测序）鉴定。其中，*T. harzianum*（PBT13）的蛋白酶活性达0.0589 U/mg，几丁质酶活性为1.089 μg/mL，显著高于其他菌株。酶活性检测显示，蛋白酶通过水解病原菌细胞壁蛋白，几丁质酶则特异性降解几丁质（真菌细胞壁主要成分），两者协同作用可有效抑制菌丝生长。

2. **拮抗活性验证**
采用双培养法发现，PBT13菌株的菌丝能缠绕并穿透病原菌菌丝，扫描电镜（SEM）显示其菌丝可破坏病原菌细胞壁结构（图5）。体外实验表明，60 U/mL的几丁质酶可将 *F. oxysporum* 和 *S. rolfsii* 的鲜重抑制率分别提升至97.1%和95.95%，且抑制作用呈剂量依赖性（图4）。

3. **协同增效机制**
稻壳生物炭的孔隙结构可增强 *Trichoderma* 的定殖与代谢产物积累。实验设计包含9种处理组合，其中：
- **T9（病原菌 + *T. harzianum* + 生物炭）**：疾病发生率降至9.6%，发芽率提高至95.1%，总酚和抗氧化酶（CAT、POD、PAL）活性分别较对照组提升81.6%和42.3%。
- **T8（病原菌 + 生物炭）**：疾病发生率降低至28.3%，但酶活性激活程度弱于T9。
- **T3（仅 *T. harzianum*）**：疾病控制率为3.2%，酶活性与T9存在显著差异（图1、表1）。

该现象表明，生物炭可能通过以下途径增强 *Trichoderma* 的生物防治效果：① 改善土壤pH（生物炭呈弱碱性）和有机质含量，促进真菌孢子萌发；② 刺激植物系统抗性（ISR），上调苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御基因表达；③ 形成物理屏障减少病原菌孢子扩散。

4. **生理响应与抗病机制**
感病对照（T2）的叶绿素含量为1.42 mg/g，而T9处理下提升至2.34 mg/g，表明生物炭与真菌的协同作用可显著缓解光合组织损伤。此外，PAL活性在T9中达0.00249 μmol/min·mg蛋白，较T1（对照组）提高104.1%，说明病原菌胁迫下苯丙烷代谢通路被充分激活，生成木质素等次生代谢物增强细胞壁抗性。

### 创新性与应用前景
该研究首次系统评估了 *Trichoderma* 菌株与生物炭的协同效应，发现两者结合可通过“直接杀伤”（胞壁降解酶）和“间接激活”（植物防御酶）双重机制发挥作用。具体表现为：
- **直接作用**：几丁质酶靶向病原菌几丁质细胞壁，蛋白酶分解真菌细胞壁蛋白，导致菌丝断裂和孢子失活。
- **间接作用**：生物炭通过吸附重金属和病原菌孢子，减少土壤中休眠体数量；同时其热解产生的酚类物质可诱导植物内源抗氧化酶（如CAT、POD）活性，清除活性氧（ROS）自由基。

研究建议，在田间推广时需注意生物炭施用量（推荐10-15 t/ha）与接种量（*Trichoderma*孢子浓度建议≥1×10^8 CFU/g），过量可能因竞争资源导致真菌失效。此外，生物炭的碳源特性可延长 *Trichoderma* 在土壤中的存活时间，维持其持续拮抗作用。

### 局限性与未来方向
尽管研究验证了协同增效作用，但仍存在以下局限：① 实验仅针对两种病原菌，未评估其他常见病原体的抗性；② 未量化生物炭碳含量（TN、TPN）与酶活性的关系；③ 田间试验周期较短（90天），需长期监测抗性衰减情况。未来研究可结合宏基因组学分析 *Trichoderma*-土壤互作机制，并开发基于生物炭载体的缓释菌剂技术。

该成果为可持续农业提供了新思路，即通过“微生物-有机基质”复合制剂替代化学农药，既降低环境污染，又通过酶促降解作用直接瓦解病原菌结构，同时激活植物免疫应答，形成多层次防御体系。