通过将traJ基因引入可移动质粒显著提高大肠杆菌至天蓝色链霉菌的接合转移效率

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Enhancing conjugation from E. coli to Streptomyces coelicolor by incorporating traJ into mobilizable plasmids

本研究针对链霉菌遗传操作中DNA传递效率低下的瓶颈问题，系统探讨了在可移动质粒中引入接合转移关键基因traJ对接合效率的影响。研究人员通过分子克隆构建了携带traJ的ΦC31整合型质粒pRASK-SP44、转座子递送载体pHL734以及双拷贝traJ的pCER质粒，实验证实traJ的引入使接合转移效率提升10-100倍。该发现为优化链霉菌基因操作工具提供了重要策略，对天然产物开发和基因组工程具有推动作用。

　　

在微生物研究领域，链霉菌因其能够产生丰富的生物活性天然产物而备受关注，这些产物在医药、农业和工业上具有重要价值。然而，对链霉菌进行遗传操作一直面临挑战，其中DNA传递效率低下是主要瓶颈之一。尽管利用去甲基化大肠杆菌进行接合转移已成为将外源DNA导入链霉菌的首选方法，但在许多菌株中，质粒转移效率仍然不理想，限制了后续基因功能研究和代谢工程应用。

接合转移过程依赖于可移动质粒上的oriT序列和辅助质粒提供的接合 machinery。在RK2来源的接合系统中，traJ基因编码松弛体复合物的关键组分，但许多常用质粒仅包含oriT而缺少traJ。这种结构差异是否影响接合效率，以及traJ的引入能否优化DNA传递过程，成为研究人员关注的核心问题。

为了回答这一问题，研究团队选取了三种不同类型的可移动质粒：ΦC31整合型质粒pRASK-SP44、携带mini-Tn5转座子的pHL734以及用于染色体末端删除的pCER质粒。通过分子克隆技术，研究人员成功构建了携带traJ的pRASK-SP44-TraJ和pHL734-TraJ，以及在pCER中引入第二个traJ拷贝的pCER-2TraJ。这些工程化质粒为系统评估traJ对接合效率的影响提供了理想工具。

研究团队采用固相接合实验，以去甲基化大肠杆菌ET12567/pUZ8002为供体菌，天蓝色链霉菌M145为受体菌，精确量化了各质粒的接合转移效率。实验结果令人振奋：traJ的引入显著提高了接合效率，其中pRASK-SP44-TraJ的转移效率提高了10倍，pHL734-TraJ提高了100倍，而双拷贝traJ的pCER-2TraJ也比单拷贝版本提高了5倍。这些数据充分证明了traJ在接合转移中的关键作用。

研究人员还通过PCR验证了质粒在转接合子中的稳定整合，确保了实验结果的可靠性。对ΦC31整合型质粒，检测了其在attB位点的整合情况；对转座子载体，确认了抗性基因的插入；对pCER质粒，验证了通过同源重组实现的染色体修饰。这些分子生物学证据共同支撑了接合效率提升的结论。

在讨论部分，研究人员深入分析了traJ提升接合效率的潜在机制。TraJ作为松弛体的正调控因子，可能通过促进松弛酶与oriT中19-bp反向重复序列的结合，增强松弛体的组装和活性。当可移动质粒自身携带traJ时，与辅助质粒pUZ8002提供的TraJ协同作用，可能进一步提高oriT处的切口形成和链置换效率，产生更多具备转移能力的质粒分子。

该研究的创新之处在于首次系统评估了traJ在链霉菌接合转移中的剂量效应，并提出了通过调控traJ存在和拷贝数来优化遗传工具的新策略。与以往主要关注培养基组成、供受体比例等物理化学参数的优化不同，这项工作从分子机制层面为提高DNA传递效率提供了新思路。

主要技术方法包括：利用分子克隆构建工程质粒，通过固相接合实验评估转移效率，采用PCR技术验证质粒整合，应用统计学方法分析数据显著性。所有实验均使用天蓝色链霉菌M145作为模型菌株。

研究结果

构建携带traJ的工程质粒

研究人员成功将oriT-traJ片段克隆至目标质粒中，获得pRASK-SP44-TraJ、pHL734-TraJ和pCER-2TraJ。质粒构建经过限制性内切酶消化、片段连接和测序验证，确保traJ正确插入且不影响质粒其他功能。

traJ显著提高接合效率

实验数据显示，traJ的引入使pRASK-SP44的接合效率从1×10^-7±0.3×10^-7提升至5.7×10^-6±1.1×10^-6；pHL734从6.7×10^-9±0.5×10^-9提升至4.8×10^-7±1.3×10^-7；pCER-2TraJ比单拷贝traJ的pCER提高5倍效率。统计学分析表明这些差异具有显著性。

验证转接合子中质粒的稳定整合

通过特异性引物PCR扩增，证实了三种类型质粒在转接合子染色体中的成功整合：ΦC31质粒通过位点特异性重组整合，转座子随机插入基因组，pCER通过同源重组删除染色体末端。

研究结论与意义

本研究证实traJ是影响大肠杆菌至链霉菌接合转移效率的关键因素。在可移动质粒中引入traJ可显著提升DNA传递效率，这一发现对链霉菌遗传操作工具开发具有重要指导意义。通过优化质粒架构而非仅调整实验条件，为克服链霉菌基因操作瓶颈提供了新途径。该策略有望促进链霉菌天然产物开发和基因组工程研究，对微生物 biotechnology 领域产生广泛影响。

值得注意的是，接合效率的提升程度因质粒类型而异，提示除了traJ之外，质粒整合机制和细胞内稳定性等因素也会影响最终结果。未来研究可探索traJ表达水平的精细调控，以及该策略在其他链霉菌物种中的普适性，进一步拓展其在微生物遗传操作中的应用前景。