热应激适应性进化提升马链球菌HC5产细菌素bovicin HC5的产量及机制解析

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Enhancing bovicin HC5 production in Streptococcus equinus HC5 through adaptive laboratory evolution under thermal stress

本研究针对具有应用潜力的细菌素bovicin HC5产量低下的问题，通过热应激适应性实验室进化（ALE）成功选育出高产马链球菌（Streptococcus equinus）HC5变异株。结果表明，经过400代47°C和48°C热胁迫进化，变异株HC5 40048的bovicin HC5产量提升140%，其bvcA前体肽编码基因表达上调，细胞膜脂肪酸组成改变（饱和脂肪酸比例增加，Zeta电位降低），且全基因组测序揭示了与蛋白修饰、转录调控及细胞转运相关基因的突变。该研究为优化细菌素生产工艺提供了新策略。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的今天，寻找传统抗生素的替代品已成为全球公共卫生领域的紧迫任务。抗菌肽（AMPs）因其化学稳定性高、细胞毒性低且不易诱导耐药性等优势，展现出巨大的应用前景。其中，由马链球菌（Streptococcus equinus）HC5产生的细菌素bovicin HC5，作为一种典型的I类羊毛硫抗生素（lantibiotic），具有优异的热稳定性和酸稳定性，以及广泛的抗菌活性，在食品保藏和农业领域潜力巨大。然而，bovicin HC5的低产量严重限制了其大规模应用。以往的产量提升策略多集中于优化培养条件，而如何通过改造生产菌株自身来突破产量瓶颈，是一个亟待解决的关键科学问题。

有意思的是，bovicin HC5带有正电荷，容易与生产者自身的细胞膜紧密结合，这虽然可能是其一种自我保护机制，但也给提取带来了困难。研究人员设想，能否通过施加环境压力，促使生产菌株发生适应性改变，从而筛选出产量更高的变异株？适应性实验室进化（ALE）作为一种强大的代谢工程策略，通过在可控条件下对微生物群体进行长期培养和定向筛选，能够富集具有优良性状（如胁迫耐受性、产物合成能力增强）的突变体。基于此，Rodrigo Dias等人假设，对S. equinus HC5施加热应激进行ALE，能够选育出细胞膜发生改变、进而提升bovicin HC5产量的菌株。

为了验证这一假说，研究团队展开了一系列实验，相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上。研究首先确定了野生型S. equinus HC5的最适生长温度为42°C，在49°C以上生长停止。随后，他们在47°C启动ALE实验，培养150代后，将胁迫温度提升至48°C，继续进行250代培养。在整个长达400代、耗时100天的进化过程中，研究人员定期监测菌株的生长情况，并最终筛选出8个表型各异的变异株进行深入表征。

为开展研究，作者主要运用了几项关键技术：首先通过测定不同温度下的生长曲线和绘制阿伦尼乌斯图确定了菌株的温度生长特性；其次，利用热应激适应性进化（ALE）技术进行菌株定向选育；接着，采用琼脂扩散法测定细菌素活性，并通过气相色谱分析膜脂肪酸组成；此外，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析了bovicin HC5生物合成基因簇（bvcATCBFEGRK）的表达水平；最后，对进化菌株进行了全基因组测序、组装和变异识别，以解析基因型变化。

效果温度对S. equinus HC5生长的影响

研究首先绘制了S. equinus HC5的生长温度曲线。结果显示，该菌株在42°C时具有最高的比生长速率（μ = 2.16 ± 0.03 h^-1）和光密度（OD_{600 nm}）。当温度超过42°C后，生长速率和生物量均开始下降，在49°C时生长几乎完全抑制。这为后续ALE实验的温度设定提供了关键依据。

-1）的影响。B: 培养24小时后温度对OD_{600 nm}的影响。'>

适应性实验室进化（ALE）

ALE过程始于47°C。在前150代，菌株的比生长速率和OD_{600 nm}均显著提升，表明其已适应此温度。当温度升至48°C后，生长参数出现短暂下降，但随后逐渐恢复并稳定在更优水平。进化终点菌株S. equinus HC5 40048在48°C下的比生长速率（μ = 1.33 ± 0.02 h^-1）和OD_{600 nm}（4.03 ± 0.06）均显著高于野生型在相同温度下的表现，显示出显著增强的耐热性。

-1）的影响。B: 热应激对OD_{600 nm}的影响。'>

通过ALE获得的S. equinus HC5变异株的表型特征

动力学生长参数

在标准培养温度（42°C）下，所有ALE变异株的生长速率和生物量均低于野生型，这表明为适应高温，菌株在常温下的生长能力做出了权衡。

600 nm）。C: 干重。D: pH值。'>

bovicin HC5的提取与特异性活性

提取方法比较发现，高温（100°C, 10 min）提取效率远优于低温（4°C, 16 h）提取。特别值得注意的是，变异株HC5 40048的提取物产生的抑菌圈最大。最关键的是，其bovicin HC5的特异性活性达到了1022.22 ± 38.49 AU mL^-1mg干重^-1，比野生型提高了140%。另一个变异株HC5 20048的产量也有显著提升。然而，在变异株的培养上清液中却检测不到细菌素活性，暗示细菌素可能更多地滞留于细胞内部或细胞膜上。

膜脂肪酸组成与Zeta电位评估

膜脂肪酸分析显示，进化菌株的膜脂组成发生了改变，例如变异株HC5 10047的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例显著高于野生型。Zeta电位测量表明，高产菌株HC5 40048的表面负电荷（-33.87 ± 1.15 mV）显著低于野生型（-43.49 ± 5.18 mV），这会影响带正电的bovicin HC5与细胞膜的相互作用。

通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析bovicin HC5生物合成基因的表达

基因表达分析揭示了产量提升的分子机制：高产菌株HC5 40048中编码前体肽的bvcA基因表达量显著上调。然而，与转运（bvcT）、免疫（bvcF, bvcE, bvcG）和调控（bvcK, bvcR）相关的基因表达却下调或与野生型相近。这表明bvcA表达的上调是驱动产量增加的关键因素。

比较基因组学

全基因组测序在进化菌株中鉴定出90个变异，其中28个为中度或高度影响的突变。这些突变富集在参与蛋白修饰（如糖基转移酶）、转录调控（如MutR和MerR家族蛋白）和细胞转运（如羊毛硫抗生素转运透膜蛋白BvcE）的基因中。尤其在HC5 20048, HC5 30048和HC5 40048中均发现bvcE基因的错义突变，这很可能导致了ABC转运系统功能受损，从而解释了为何细菌素无法有效分泌到胞外。

研究结论与意义

本研究成功利用热应激ALE技术选育出bovicin HC5高产菌株S. equinus HC5 40048，其产量提升140%。这种提升主要归因于前体肽编码基因bvcA的表达上调，增加了前体肽的供应。同时，研究揭示了伴随高产性状的其他重要变化：菌株获得了更强的耐热性；细胞膜组成发生改变，饱和脂肪酸比例增加，膜刚性增强；细胞表面Zeta电位降低，与带正电的bovicin HC5相互作用增强；以及关键的转运蛋白基因突变可能造成细菌素在胞内积累。

该研究的创新之处在于，首次系统地将ALE应用于提高S. equinus HC5的细菌素产量，并深入阐述了其背后的生理、分子及遗传机制。它不仅证实了ALE在优化细菌素生产方面的有效性，为工业化生产提供了高性能的候选菌株，更重要的是，通过鉴定bvcA表达为限速步骤以及膜特性改变对产物回收的影响，为未来通过靶向基因工程进一步优化bovicin HC5乃至其他细菌素的生产策略提供了宝贵的见解和明确的靶点。这项研究为克服细菌素生产的瓶颈问题开辟了一条新颖且高效的途径，有力地推动了这种天然抗菌剂在多个领域的潜在应用。