氯喹通过清除休眠癌细胞克服化疗耐药并抑制癌症转移

《Cell Death & Disease》：Chloroquine Overcomes Chemotherapy Resistance and Suppresses Cancer Metastasis by Eradicating Dormant Cancer Cells

为解决化疗耐药和肿瘤复发转移的临床难题，研究人员开展了一项关于氯喹(CQ)联合化疗药物的主题研究。结果表明，在骨肉瘤和结直肠癌模型中，氯喹通过有效抑制化疗诱导的保护性自噬，显著增强细胞死亡，并优先清除耐药休眠细胞，从而克服耐药性并抑制转移。这项研究为基于自噬抑制的联合疗法提供了新的策略。

　　

癌症治疗领域长期面临着两大严峻挑战：一是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，导致治疗失败；二是即便初期治疗有效，肿瘤仍可能复发和远处转移，严重影响着患者的生存期。其中，休眠的癌细胞被认为是导致治疗后复发的“罪魁祸首”，它们像种子一样潜伏在体内，对常规化疗不敏感，伺机而动。因此，寻找能够有效清除这些休眠癌细胞、并克服化疗耐药的新策略，成为癌症研究的热点。

在这项发表于《Cell Death & Disease》的研究中，研究人员将目光投向了细胞自噬（Autophagy）这一关键细胞过程。自噬如同一把双刃剑，在正常情况下维持细胞稳态，但在肿瘤中，它常常被激活作为一种保护机制，帮助癌细胞在化疗药物的压力下存活下来，从而产生耐药性。那么，抑制自噬能否成为增强化疗效果、防止复发转移的突破口呢？

为了回答这个问题，研究团队选择了一种老药新用的候选者——氯喹（Chloroquine, CQ）。氯喹是一种已被美国FDA批准用于治疗疟疾等疾病的药物，因其能够抑制自噬过程的晚期阶段（即自噬体与溶酶体的融合）而备受关注，并已进入多种癌症的临床试验。研究人员假设，将氯喹与常规化疗药物联用，可能通过阻断癌细胞的“自救”通路，从而克服耐药性，并特别针对那些难以被清除的休眠癌细胞。

本研究主要运用了以下几类关键技术方法：利用患者来源的化疗耐药骨肉瘤细胞系（OS921, OS1056）和小鼠结直肠癌细胞系（CT-26 luc）建立体外模型；通过shRNA慢病毒转导构建ATG5基因敲低细胞株以进行遗传学验证；使用EGFP-mCherry-LC3B报告系统并结合流式细胞术、Western blot、RT-PCR动态监测自噬流；通过MTT法、xCELLigence实时细胞分析、Annexin V/PI染色流式细胞术、集落形成实验、划痕愈合实验等评估细胞活力、增殖、凋亡和迁移；建立3D肿瘤细胞球体模型模拟体内肿瘤行为；并最终在小鼠结直肠癌原位移植模型中评估氯喹联合奥沙利铂对肿瘤生长和转移的抑制效果。

Anticancer drugs etoposide and oxaliplatin induce autophagy activation in osteosarcoma and colorectal cancer cells

研究首先证实，化疗药物本身会激活癌细胞的自噬。在骨肉瘤细胞（HOS, OS921, OS1056）和小鼠结直肠癌细胞（CT-26）中，依托泊苷（Etoposide）和奥沙利铂（Oxaliplatin, OxP）处理均能剂量依赖性地上调自噬关键基因（ULK1, Atg7）的表达，并增加自噬相关蛋白（如Atg5, LC3-II）的水平，同时降低自噬底物p62的含量，表明自噬流被激活。值得注意的是，从多次化疗后复发患者肺转移灶中分离的OS921和OS1056细胞，对依托泊苷表现出更强的固有耐药性。

Chloroquine enhances the efficacy of etoposide in osteosarcoma and oxaliplatin in colorectal cancer

接下来，研究人员探索了氯喹的增效作用。他们发现，氯喹与化疗药同时给药效果不佳，而预先用氯喹处理16小时，再给予化疗药，则能产生强大的协同杀伤效应。机制上，这种预处理的优势在于能够更彻底地阻断化疗药物诱导的自噬流，这一点通过EGFP-mCherry-LC3B报告系统的荧光成像和流式细胞术定量分析得到了直观证实。MTT法和实时细胞分析（xCELLigence）显示，氯喹预处理的方案能显著增强依托泊苷对骨肉瘤细胞（尤其是耐药的患者来源细胞）和奥沙利铂对CT-26细胞的杀伤作用，而在正常皮肤成纤维细胞中，氯喹反而表现出一定的保护作用。Annexin V/PI染色表明，联合处理促进了癌细胞的凋亡和坏死。更重要的是，通过构建ATG5基因敲低细胞株，研究证实了氯喹的增敏作用确实是通过抑制自噬实现的，因为基因敲低自噬关键蛋白ATG5能模拟氯喹的效应。在更接近体内环境的3D肿瘤球体模型中，氯喹与化疗药的联合也导致了球体结构的瓦解和ATP活性的急剧下降，证明了其在复杂结构中的有效性。

CQ, introduced into the chemotherapy regimen, prevents the ability of osteosarcoma and mouse colorectal cancer cells to develop metastatic phenotype in vitro and in vivo

研究进一步探讨了氯喹对肿瘤转移特性的影响。体外实验表明，虽然化疗单药有时会意外上调上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）标志物（如Snail1, TWIST）的表达，但氯喹的加入能显著逆转这一现象，并有效抑制癌细胞的迁移能力（划痕实验和Transwell迁移实验）。集落形成实验则揭示，经氯喹和化疗药联合处理后，残存的癌细胞失去了从单个细胞重新形成集落的能力，暗示其再生和复发潜力被极大削弱。最关键的支持来自体内实验：在小鼠结直肠癌原位模型中（将CT-26 luc细胞注射到盲肠黏膜下），与单独使用氯喹或奥沙利铂相比，两者联合治疗不仅最有效地抑制了原发性肿瘤的生长（通过生物发光成像评估），延长了小鼠的生存期，更重要的是，在联合治疗组的小鼠中，通过肉眼观察和检测转移器官中荧光素酶（Luciferase）的表达，均未发现肝、肺、脾等远处器官的转移灶，而其他各组均存在不同程度的转移。

Chloroquine exhibits greater toxicity toward dormant cancer cells than proliferating cells

为了解释联合疗法为何能如此有效地抑制转移，研究人员将焦点对准了休眠癌细胞。他们通过血清饥饿（将培养基中胎牛血清浓度降至0.1%）成功诱导了骨肉瘤和CT-26细胞的休眠状态。这些休眠细胞表现出细胞周期G0/G1期阻滞、增殖标志物（Aurka, Ki67）下调、自噬活性增强、EMT和干细胞特性（CD44, ALDH1）相关基因表达上调，并且对化疗药物不敏感。然而，一个关键的发现是：氯喹对这类休眠细胞表现出显著的偏好性杀伤作用。Annexin V/PI染色和MTT实验均证实，与快速增殖的细胞相比，休眠细胞在氯喹处理后死亡率显著更高。另一个自噬抑制剂MRT68921也表现出类似的效果。

综上所述，本研究得出了明确的结论：化疗药物会激活癌细胞的自噬作为保护性机制，从而贡献于化疗耐药。采用预先给予氯喹的策略，可以有效且彻底地抑制这种治疗诱导的自噬。氯喹与常规化疗药物的联合应用，展现了一种双管齐下的协同抗癌机制：化疗药主要负责清除快速增殖的肿瘤细胞主体，而氯喹则能特异性靶向清除那些对化疗不敏感、具有干细胞特性、且与复发转移密切相关的休眠癌细胞库。这种联合策略在体外和体内模型中均能有效克服化疗耐药、抑制肿瘤生长，并显著降低转移风险。

这项研究的意义重大。它不仅在机制上深入阐明了自噬在化疗耐药和肿瘤转移中的作用，更重要的是，为临床克服这些难题提供了一个具有高度转化潜力的治疗策略。氯喹作为一种已上市的老药，其安全性、药代动力学特征已有大量数据，这为其与化疗联合的临床转化应用提供了便利，有望为骨肉瘤、结直肠癌等恶性肿瘤患者带来新的希望。