基于HepaRG细胞高通量磷脂质沉积检测的新方法在代谢干扰评估中的应用

《Archives of Toxicology》：New approach methodologies for metabolic disruption: a high-throughput human liver cell phospholipidosis assay

为解决药物诱导磷脂质沉积(PLD)传统检测方法通量低、耗时长的难题，研究人员开发了基于分化HepaRG细胞和LipidTOX荧光检测的高通量筛选模型。该研究通过对35种已知PLD诱导/非诱导化合物的测试，证实模型预测准确率达86%，显著优于现有计算机模型，为肝毒性安全评价提供了高效可靠的体外新方法(NAM)。

　　

当我们服用某些药物时，肝脏可能会悄悄发生一种叫做磷脂质沉积(Phospholipidosis, PLD)的病理变化——磷脂分子在细胞内异常堆积，形成层状小体。这种现象最早在20世纪70年代被发现，尤其常见于阳离子两亲性药物(Cationic Amphiphilic Drugs, CADs)的治疗过程中。虽然PLD通常是可逆的，但长期积累可能影响细胞功能，因此在新药研发早期快速识别化合物的PLD诱导潜力至关重要。

传统上，科学家依赖电子显微镜观察组织切片中的层状小体，这种方法虽然精确但效率低下，难以满足大规模化合物筛选需求。随着动物实验伦理争议和物种差异问题的凸显，开发"新方法学"(New Approach Methodologies, NAMs)成为毒理学研究的新方向。计算机预测模型通过计算化合物的pK_a和ClogP等理化参数来预测PLD风险，但无法模拟生物体内的复杂代谢过程；常用肝细胞模型HepG2又因缺乏关键代谢酶而功能受限。这些问题促使研究人员寻找更优解决方案。

在此背景下，德国联邦风险评估研究所的Neele Wewer团队在《Archives of Toxicology》发表研究，建立了基于人源HepaRG细胞的高通量PLD检测平台。HepaRG细胞具有稳定的肝脏特异性功能，能表达丰富的药物代谢酶，是理想的体外肝模型。研究人员采用LipidTOXTM Red荧光染料标记磷脂，结合高内涵成像技术，实现了对35种化合物的快速筛选。

关键技术方法包括：使用分化HepaRG细胞培养模型，通过WST-1法测定细胞毒性确定安全浓度范围，应用LipidTOX荧光染色和高内涵成像系统(ZEISS Celldiscoverer 7)定量磷脂积累，采用浓度-效应曲线分析和统计学方法评估PLD诱导潜力。

研究结果

磷脂在HepaRG细胞中积累 after exposure to test compounds

研究人员测试了20种已知体内PLD诱导剂和15种非诱导剂。浓度-效应曲线显示不同化合物诱导强度差异显著：氟哌啶醇(haloperidol)诱导强度最高(磷脂积累超600%)，红霉素(erythromycin)为中等强度(约300%)，而卡马西平(carbamazepine)无诱导作用。曲线形态也呈现多样性：部分化合物随浓度增加磷脂持续积累，部分出现平台期，少数甚至在高浓度时出现下降趋势——后者与细胞毒性无关，可能反映不同的作用机制。

不同PLD模型磷脂积累的比较

与体内数据对比，该方法的灵敏度达95%(19/20)，特异性73%(11/15)，总体预测准确性86%。与计算机预测模型相比，体外方法对红霉素等抗生素的PLD检测更敏感，因为这些化合物的低ClogP值导致计算机模型出现假阴性。与其他肝细胞模型(HepG2)相比，HepaRG细胞能更准确模拟氟哌啶醇等需要代谢激活的化合物的PLD效应，凸显其代谢功能优势。

研究结论与讨论

本研究首次系统验证了LipidTOX检测在HepaRG细胞中用于PLD高通量筛查的可靠性。86%的预测准确性表明该模型能有效弥补计算机模型和传统检测方法的不足。特别值得注意的是，该方法能检测经代谢转化后具有PLD潜力的化合物，这对评价前体药物的安全性尤为重要。

曲线形态的多样性提示PLD可能存在多重分子机制：包括磷脂-药物复合物形成、磷脂酶抑制、磷脂合成增加或胆固醇生物合成影响等。平台期和下降型曲线的出现可能反映不同作用机制而非单纯的饱和度限制，这为后续机制研究提供了线索。

虽然体外测试浓度可能高于体内血药浓度，但该方法为优先筛选和机制研究提供了实用平台。未来可应用于化合物混合物效应研究、肝脂质代谢干扰评估以及PLD分子机制解析。结合计算机模型，可构建分层测试策略，显著提高药物安全性评价效率。

这项研究不仅建立了高效的PLD预测模型，更展示了人类相关体外模型在毒理学风险评估中的价值。随着NAM理念的深入，这类细胞模型将在减少动物实验、提高预测准确性的双重目标中发挥关键作用，推动毒理学研究向更人性化、更精准的方向发展。