揭示烯丙基和苄基C(sp3)–H键原位一级胺化的区域选择性和立体选择性：结构评估的关键作用

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Unveiling the regio- and stereo-selectivity in situ primary amination of allylic and benzylic C(sp3)–H bonds: The pivotal role of structural evaluation

本研究结合分子动力学模拟与量子力学计算，系统探究铁硝基物种催化C(sp3)–H键氨基化的选择性机制。通过分析动态构象与过渡态能量表面，揭示了攻击距离和角度的几何一致性对底物选择性的关键作用，并成功预测了1-苯基-1-环己烯等活性及非活性底物的反应倾向性。该研究为酶理性改造和催化系统设计提供了新方法。

　　

杨增|薛江|史宇欣|司玉军|杨丽军

四川省精准合成与功能开发重点实验室，中国西华师范大学化学与化学工程学院，南充637002，中国

摘要

血红素酶的定向进化在催化构建苄基C(sp³)–N键方面受到了广泛关注。然而，在酶催化的C(sp³)–H活化步骤中实现区域选择性和立体选择性控制仍然是一个重大挑战。本研究通过过渡态（TS）定义的势能面，能够合理解释某些反应底物（如1-苯基-1-环己烯（a）中C(sp³)–H在烯丙基或苄基位置的选择性胺化过程。然而，这种方法不适用于某些非反应性底物，例如烯丙基苯（l）。要全面理解这一过程，需要能够解决高度多维问题的方法。结构一致性分析表明，在分子动力学（MD）模拟快照中同时考虑攻击距离和角度时，类似于TS的构象有助于高效地抽取氢原子并在预测位置进行位点选择性的酶促胺化。相比之下，非反应性底物很少能够形成有利于C–H键抽取的几何构型。总体而言，这些结果突显了由细胞色素P450酶介导的烯丙基或苄基C–H键胺化过程中由于几何要求不同而产生的选择性。

引言

伯胺是一类高反应性化合物，广泛用作工业材料生产中的关键中间体[1]。在医药领域，近40%的分子含有伯胺结构。传统的伯胺合成方法主要包括硝基化合物、叠氮化物和腈的还原胺化；羰基的还原胺化；S_N2取代或卤代烃的加布里埃尔反应；以及醇的脱氢偶联[[2], [3], [4]]（图1A）。然而，这些方法通常需要对底物进行预功能化，导致程序繁琐且合成效率有限。目前，通过C(sp³)–H键的胺化反应直接引入NH₂被认为是最理想的策略[5,6]。近年来，由于酶催化技术的温和条件和环保性，引起了人们的关注。研究人员通过引入非天然酶催化剂，通过定向进化实现了伯胺的绿色和经济合成[7,8]。Arnold小组[9]通过持续实验，开发了一种基于工程化P411酶的新催化系统，首次实现了烯丙基和苄基C(sp³)–H键的直接胺化。随后，其他研究小组也实现了C(sp²)–H键的直接胺化、未保护的手性α-氨基酯的合成以及通过分子内胺化形成内酰胺[10,11]（图1B）。

然而，酶催化的C–H胺化领域仍面临两个关键科学挑战。首先，目前的酶修饰方法主要依赖于大量的随机突变实验，由于缺乏合理的设计指导，获得催化活性在很大程度上是偶然的。其次，精确调控区域选择性和立体选择性仍然难以实现。尽管铁催化的伯胺化系统在扩大底物范围和提高反应效率方面取得了显著进展[11,12]，但机理研究仍然不够深入。这种认知差距主要体现在三个方面：（1）不同团队报告的伯胺合成区域选择性数据存在显著差异[9,13]；（2）关键中间体的实验表征在技术上具有挑战性；（3）控制伯胺形成位点选择性的因素尚未得到彻底研究。这些机理研究中的瓶颈阻碍了催化系统的合理优化。因此，建立可靠的活性和选择性预测模型对于促进该领域的发展具有重要意义。

烯丙基和苄基C(sp³)–H键的伯胺化反应首先通过氢原子转移（HAT）步骤形成自由基中间体，随后NH₂自由基反弹生成伯胺（图1C）。从结构上看，底物1-苯基-1-环己烯（a）在其双键旁边有两个碳原子，每个碳原子都可以采取R-或S-构型。P411的定向进化能够区分高度相似的烯丙基C–H键，并仅产生单一的区域异构体。现有研究已经证实，底物的几何构型发生微小变化会显著影响其在酶催化环境中的反应选择性[14]。然而，实验方法在表征瞬态中间体和阐明影响选择性的因素方面能力有限，而理论模拟可以提供预测性见解并揭示原子尺度的动态信息。受Stephen G. Bell的[15]动态构象分析方法的启发，本研究提出了一种结合分子动力学（MD）模拟与量子力学（QM）计算的研究策略，基于几何一致性建立预测模型。MD模拟研究了底物构象的动态演变及其与催化中心的匹配行为，而QM计算精确捕获了过渡态（TS）结构和反应性。该方法旨在阐明影响烯丙基和苄基C(sp³)–H胺化选择性的关键因素，并提供一种可行的方法来合理预测反应性和选择性。

系统设置和经典MD模拟

酶-底物复合物的初始结构来自蛋白质数据库（PDB ID：5UCW）[16]。在血红素铁上方添加一个-NH基团，模拟了近端轴向配体，生成了野生型（WT）酶构建体。使用PyMOL 2.6[17]对WT酶进行定点突变，生成了突变酶（命名为Mut），突变位点为：V78M、E267D、G268P、T327A、N395R、L437F和S438A。这些选定的残基之前已经

相互作用分析

MD模拟显示WT-a和Mut-a系统的行为存在显著差异。WT-a和Mut-a系统的RMSD值（图2A）表明，蛋白质主链和活性中心分别在30 ns和75 ns时达到平衡。底物a在整个模拟过程中表现出动态波动，这与底物和蛋白质之间的弱结合力有关，主要是由于疏水相互作用（图2B）。值得注意的是，构象

结论

本研究结合了MD模拟和QM计算，深入探讨了铁-氮烯物种选择性激活烯丙基和苄基C(sp³)–H键以合成伯胺的潜在机制。QM结果证实了在1-苯基-1-环己烯中C1–H_R激活的优先选择性，这一点通过三个关键参数得到验证：BDE、自由能障碍和反应速率常数。扩大底物范围表明，静态TS能量障碍

CRediT作者贡献声明

杨增：撰写——原始草稿，可视化，形式分析，概念化。薛江：验证，研究。史宇欣：数据管理。司玉军：监督。杨丽军：撰写——审稿与编辑，资源提供，概念化。

作者声明

作者声明与本文的研究、作者身份和/或发表无关的潜在利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国西华师范大学优秀人才研究基金（17YC037）、四川省高等教育机构绿色化学重点实验室启动项目（LZJ2302）和Origiant Pharmaceutical Co., Ltd的支持。