《Journal of Inorganic Biochemistry》：Differences in functional cross-talk between loops C and D in two mitochondrial cytochromes
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细胞色素c突变体G41S和Y48H的结构稳定性与功能差异比较，发现人源与马心源蛋白因残基46的Tyr/Phe差异导致氢键网络和电子传递特性不同，hh突变体loop C与D接触减少且loop D动力学增强，而hu突变体稳定性下降更显著。
申东宇（Dong-Woo Shin）|钟芳芳（Fangfang Zhong）|普列特涅娃（Ekaterina V. Pletneva）
美国达特茅斯学院化学系，汉诺威，NH 03755
摘要 细胞色素（cyt）c中的血红素被C环和D环所包围，这两个环在不同物种中的序列存在差异。人类（hu）cyt c中的G41S和Y48H突变与血小板减少症有关，并已被广泛研究。本文描述了这些突变在马心（hh）cyt c中的效应，并将其与人类蛋白中的效应进行了比较。虽然野生型（WT）hu和hh cyt c蛋白具有相似的整体稳定性，但hh蛋白的展开过程合作性较低。这些差异在突变体中更为明显。通过分子动力学（MD）模拟和碱变性过程的实验研究，探讨了环的动力学特性。在hh cyt c中，G41S和Y48H突变导致C环与D环的接触减少，而D环的动力学增强。只有Y48H突变降低了hh cyt c的还原电位，但G41S和Y48H突变都提高了过氧化物酶的活性。在碱变性过程中，Met到Lys配体转换的速率常数k_f在人类和马心cyt c突变体中有所不同：该速率常数在人类蛋白突变体中降低，而在马心蛋白突变体中升高。观察到的趋势可以通过两种蛋白的序列差异来解释，特别是第46位残基的身份及其与D环的相互作用差异。
引言 小分子血红素蛋白细胞色素（cyt c）一直是蛋白质折叠研究的重要对象[[1], [2], [3], [4]]。该蛋白由具有不同热稳定性的明确折叠区域（折叠子，图1A）组成。在cyt c的五个折叠子中，C环（红外折叠子，残基40至55）和D环（红色折叠子，残基70至85）的稳定性最低且结构最不规则，但相对保守。低稳定性环C和D的动力学与血红素的暴露及不同配位构象的形成有关，因此对细胞色素在细胞呼吸和凋亡中的功能至关重要[[5], [6], [7]]。此外，对cyt c变体的研究还表明这两个环之间存在相互作用[[8], [9], [10], [11], [12]]。
在人类（hu）cyt c中，C环中的几个突变与遗传性血小板减少症有关[[13]]。其中，G41S和Y48H突变已被深入研究[[9],[14],[15],[16],[17]]。为了更好地理解这些突变在C环中的影响，我们选择了与马心（hh）cyt c的类似变体进行比较研究。这两种线粒体蛋白的序列同源性约为88%，主要差异位于C环和D环（图1B）。我们认为，比较人类和马心的系列有助于了解这两个环之间的相互作用，因为这两种蛋白的整体稳定性相似，因此可以关注局部动力学的本质差异。
野生型（WT）hu（蛋白质数据库（PDB）ID：3ZCF）[15]和hh（PDB ID：
1HRC ）[18]细胞色素蛋白的晶体结构显示出高度的结构相似性（骨架均方根偏差（RMSD）为0.27 ?），包括两种蛋白中相似的氢键（HB）和范德华（vdW）相互作用（图2）。cyt c中的广泛HB网络连接了C环、D环以及位于卟啉碳位点6和7的两个血红素丙酸酯基团HP6和HP7。这两种蛋白中都存在许多围绕血红素的HB网络元素，包括由保守残基38、41、48、52和59与HP7形成的相互作用（图2A）。然而，也存在显著差异。具体来说，hu cyt c中的第46位残基是Tyr，而hh蛋白中的第46位残基是Phe（图1B），并且根据该残基是Tyr还是Phe，其周围的HB网络也有明显差异（图2）。Met80到Lys配体替换（称为碱变性）的热力学和动力学参数在两种蛋白中有所不同[[9,19]]，这突显了它们环动力学的本质差异。
本文报告了G41S和Y48H突变对马心cyt c整体和局部稳定性的影响。通过对人类和马心系列进行分子动力学（MD）模拟，揭示了这两个环之间的相互作用以及G41S和Y48H突变对环动力学的影响。通过比较人类和马心系列，我们展示了这些突变及其附近残基如何影响与环重排、血红素铁上的配体解离和替换相关的热力学和动力学过程，最终影响蛋白质的功能。
部分说明 一般说明 所有水溶液均使用Barnstead E-Pure Water System纯化的水制备，电阻率达到18 MΩ·cm。除非另有说明，试剂和色谱柱均来自Millipore Sigma和GE Healthcare。所有滴定和定量稀释均使用密封的Hamilton注射器进行。pH值使用Fisher Scientific的AB15 pH计或Denver Instrument的UB10 pH计进行调节。缓冲液经过Chelex树脂处理。
结构模型与分析 目前，已获得所研究的所有三种人类（hu）cyt c变体（WT、G41S、Y48H）[15,16,38]的实验结构，但仅获得了马心（hh）cyt c WT的结构[18]。因此，为了进行比较分析，我们选择了对所有六种蛋白进行MD模拟。
WT蛋白的MD模拟 MD模拟（图S2）再现了晶体结构（图2）中观察到的涉及C环、60螺旋和D环的残基间接触差异，验证了模拟在结构比较中的有效性。
这两种蛋白的稳定性相似，但合作性不同 对于人类或马心的WT cyt c，监测α-螺旋特征和Met配位得到的ΔG_D值在误差范围内相似，表明展开过程通常具有合作性。尽管hh和hu WT cyt c蛋白的复合ΔG_D = mGuHCl/2值（表2）相当，但转变的斜率和相应的m_D值并不相同（图6A和表2）。由于这些蛋白的螺旋区域序列和堆积方式保守（图1B和表S4），因此存在差异。
结论 虽然WT hu和hh cyt c蛋白的整体稳定性相似，但它们的折叠子之间的相互作用不同。hu cyt c的展开过程更具合作性，而C环中的G41S和Y48H突变比hh cyt c中的相同突变更显著地降低了蛋白稳定性。hh cyt c中的突变通过减少和改变环间的接触增强了两个环的动力学。相同的突变也增强了hu cyt c中的环动力学，但部分环间HB接触仍然存在。
CRediT作者贡献声明 申东宇（Dong-Woo Shin）： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，正式分析，数据管理。钟芳芳（Fangfang Zhong）： 撰写 – 审稿与编辑，正式分析，数据管理。普列特涅娃（Ekaterina V. Pletneva）： 撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢 本研究得到了NIH 的资助（R01-GM098502（给E.V.P.）和P20-GM113132（达特茅斯大学COBRE生物分子靶向研究所）。我们感谢Bruce E. Bowler对本研究早期草稿的评论。D.-W.S.和E.V.P.感谢Harry B. Gray在他实验室期间的宝贵项目经验，包括对cyt c折叠动力学的研究，以及在加州理工学院期间及之后的出色指导，使他们成为Gray团队的成员。
