疱疹病毒复制机器新视角：HSV-1解旋酶-引发酶primosome结构机制突破

《Cell Discovery》：Structural and mechanistic insights into the herpes simplex virus type 1 helicase-primase primosome

本研究针对疱疹病毒复制关键机制不清的问题，通过冷冻电镜技术解析了HSV-1解旋酶-引发酶primosome与ssDNA/ADP复合物的高分辨率结构（3.47 ?），首次揭示其独特的异源三聚体构象和双向旋转解旋机制，为广谱抗病毒药物研发提供了重要结构基础。

　　

在病毒学领域，人类单纯疱疹病毒1型（HSV-1）作为一种全球广泛传播的病原体，感染率在0-49岁人群中超过67%，其潜伏感染和周期性复发的特性给公共卫生带来持续挑战。该病毒的双链DNA基因组复制过程依赖于七个核心蛋白组成的精密分子机器，其中由UL5、UL52和UL8三个亚基构成的解旋酶-引发酶primosome尤为特殊，它同时承担着DNA解链和RNA引物合成的双重功能，成为抗病毒药物开发的重要靶点。

然而，与结构研究较为充分的DNA聚合酶UL30-UL42复合物相比，这种独特的异源三聚体primosome的分子机制一直笼罩在迷雾中。传统解旋酶多采用单体或六聚体形式，而HSV-1的SF1B家族解旋酶UL5却以三聚体形式发挥作用，这种非典型结构特征使得研究人员难以理解其工作机制。更紧迫的是，随着阿昔洛韦等传统药物耐药性问题日益严重，开发针对primosome的新型抗病毒药物迫在眉睫，但缺乏高分辨率结构信息严重阻碍了理性药物设计进程。

为解决这一难题，武汉大学董长江教授团队在《Cell Discovery》上发表了突破性研究成果。研究团队通过系统的生物化学分析和冷冻电镜技术，成功解析了HSV-1 primosome与单链DNA、ADP和镁离子复合物的高分辨率结构，首次在原子水平揭示了这一关键复制机器的精细构造和工作原理。

关键技术方法包括：采用Bac-to-Bac系统共表达UL5-UL52-UL8三组分复合物，通过镍柱亲和层析和分子筛色谱进行纯化；利用ATP酶活性检测和DNA解旋实验验证复合物功能；采用冷冻电镜单颗粒分析技术获得3.47 ?全局结构，并通过局部重构将核心区域分辨率提升至3.34 ?；结合点突变和功能验证确定关键活性位点。

The architecture of the primosome

研究显示primosome采用1:1:1化学计量比的异源三聚体结构，整体尺寸为192.25 ?×101.25 ?×83.89 ?。UL52引发酶通过其N端和铰链结构域与UL5解旋酶相互作用，而UL52的AEP结构域则与UL8辅助蛋白的拇指结构域连接，形成独特的空间构象。值得注意的是，UL8与UL5之间没有直接接触，这表明UL52在复合物组装中起到桥梁作用。

The helicase structure

UL5解旋酶包含七个结构域，其中1A和2A结构域呈现典型的RecA样折叠。与T4噬菌体Dda和人Pif1等SF1B家族成员相比，UL5具有更大的分子表面面积（35,723 ?2），特别是在2B结构域表现出显著的结构差异，这可能与其独特的三聚体功能和调控机制相关。

The ATPase active site

结构分析发现ADP和镁离子结合在UL5的ATP酶活性中心，关键残基Ser104、Asp249和Glu250参与催化过程。与Pif1的结构比对显示这些催化残基在进化上高度保守。功能实验证实Ser104Ala突变体显著降低了解旋酶活性，验证了该位点的关键作用。

ssDNA binds within the fully open interdomain groove of the helicase

研究发现UL5的1A和2A-2B结构域之间形成完全开放的带正电荷的DNA结合沟槽，可容纳单链DNA。关键残基Phe146、Phe151、Arg505和Arg507通过疏水作用和氢键与DNA相互作用。与Thermus oshimai Pif1的比较显示UL5的2A结构域相对1A旋转约20°，2B结构域发生构象重排，形成了更宽的DNA结合沟槽。

Primase structure

UL52引发酶包含四个结构域，其中AEP结构域与人PrimPol和猴痘病毒引发酶具有结构相似性。通过结构比对发现Lys829、Arg823、Arg537可能参与NTP结合，而Asp630、Asp628和Asp812构成引物合成的催化三联体，这与之前的功能研究结果一致。

Structure of the accessory protein

UL8辅助蛋白呈现类似B家族DNA聚合酶的环形结构，但表面电荷分布分析表明其缺乏DNA聚合酶活性，这解释了为什么UL8特异性结合长于50 nt的单链DNA而非典型模板-引物DNA。

Extensive interactions between helicase UL5 and primase UL52

UL52与UL5之间形成2801.1 ?2的广泛相互作用界面，涉及多个极性接触和疏水作用。值得注意的是，ATP结合位点靠近两个亚基的界面，这为理解解旋酶与引发酶活性之间的偶联机制提供了线索。

Interaction of the primase UL52 and the accessory protein UL8

UL52与UL8通过AEP结构域和拇指结构域相互作用，埋藏表面积达1203.3 ?2。引发酶活性中心靠近这一相互作用区域，暗示UL8可能通过变构调节影响引发酶活性。

Dynamics of the primosome

三维变异性分析显示primosome具有显著的构象动态性：UL5的1A和2A-2B结构域通过顺时针和逆时针旋转调节DNA结合沟槽的大小，而UL52的NTD结构域与解旋酶协同运动。这种动态特性与解旋酶利用ATP水解驱动DNA解链的机制相一致，同时引发酶活性位点的构象变化提示两种活性可能通过交替机制进行协调。

研究结论表明，HSV-1三聚体primosome采用了一种前所未有的结构构象和工作机制。结构捕获的完全开放DNA结合沟槽状态为理解SF1B家族解旋酶的DNA结合和易位机制提供了新视角。特别重要的是，研究发现抗病毒药物普瑞替韦（pritelivir）和阿门那韦（amenamevir）的耐药突变位点均位于UL5的2A结构域，且靠近ADP结合位点，这为理解药物作用机制和设计新一代抗病毒药物提供了关键结构信息。

该研究的科学意义不仅在于首次揭示了HSV-1复制机器的关键组件结构，更重要的是提出了双向旋转解旋机制和DNA依赖性ATP酶激活模型。鉴于疱疹病毒科成员均保守采用这种三聚体primosome结构，该研究成果为开发广谱抗疱疹病毒药物奠定了坚实基础，同时为理解其他病原DNA病毒的复制机制提供了重要参考框架。