去甲苯醌通过抑制分枝杆菌呼吸链复合体III2IV2超复合体和细胞色素bd氧化酶双重靶点抑制结核分枝杆菌生长

《Communications Biology》：Mycobacterial respiratory chain enzymes and growth are inhibited by decylubiquinone

本研究针对结核病治疗中分枝杆菌分支呼吸链难以被单一抑制剂完全阻断的难题，揭示了去甲苯醌（DCQ）能同时抑制耻垢分枝杆菌CIII2CIV2超复合体和细胞色素bd-I的醌氧化活性，并通过冷冻电镜证实DCQ竞争性结合于CIII2的Qo位点。DCQ可有效抑制耻垢分枝杆菌生长，并在人源巨噬细胞感染模型中显著降低结核分枝杆菌H37Rv的胞内增殖，为开发靶向分枝杆菌能量代谢的新型抗结核药物提供了新策略。

　　

在对抗结核病这场旷日持久的战争中，科学家们一直面临着巨大的挑战。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）作为引起结核病的元凶，其顽强的生命力部分源于其独特而复杂的能量代谢系统。与人类线粒体中使用泛醌（Ubiquinone, UQ）作为电子载体不同，分枝杆菌依赖于一种电位更低的醌类——甲基萘醌（Menaquinone, MQ）来传递电子。更棘手的是，分枝杆菌的呼吸链是“分支”的，这意味着电子从MQH₂（还原型甲基萘醌）流向氧气（O₂）有两条主要路径：一条是通过由复合体III（CIII₂，又称细胞色素bc₁复合体）和复合体IV（CIV，又称细胞色素c氧化酶）组成的固定超复合体（CIII₂CIV₂）；另一条则是通过细胞色素bd型氧化酶。这种冗余设计就像给细菌的“能量工厂”上了双保险，当其中一条通路被药物抑制时，细菌可以切换到另一条通路继续生存，这导致了像Q203（Telacebec）这类只靶向CIII₂CIV₂通路的药物在临床应用中效果受限。因此，开发能够同时阻断两条呼吸链分支的抑制剂，成为消灭持久性结核分枝杆菌的关键。

在此背景下，一个有趣的问题产生了：如果让分枝杆菌“误食”其通常不使用的、电位更高的电子载体——类似于哺乳动物的泛醌，会发生什么？这会不会干扰其正常的能量代谢？发表在《Communications Biology》上的这项研究正是基于这一设想，探究了去甲苯醌（Decylubiquinone, DCQ），一种常用的泛醌类似物，对分枝杆菌呼吸功能及生长的影响。

为了回答核心问题，研究人员综合运用了生物化学、结构生物学和细胞生物学等多种技术手段。关键方法包括：1）使用克拉克氧电极（Clark-type oxygen electrode）精确测量分离纯化的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）CIII₂CIV₂超复合体和细胞色素bd-I的醌氧化活性（以DMNQH₂为底物）及其在DCQ存在下的抑制情况；2）通过冷冻电子显微镜（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）技术解析DCQ与CIII₂CIV₂超复合体结合的高分辨率结构，直观展示其作用位点；3）利用固体培养基生长实验评估DCQ对耻垢分枝杆菌的直接生长抑制作用；4）建立基于人原代单核细胞来源巨噬细胞（human monocyte-derived macrophages）的结核分枝杆菌感染模型，结合高内涵成像（IncuCyte）和流式细胞术（Flow cytometry），评估DCQ在更接近生理环境的条件下对胞内病原体生长的抑制效果。

研究结果

Naphthoquinol oxidation activity of the isolated CIII₂CIV₂supercomplex 和 DMNQH₂oxidation activity of the isolated cytochrome bd-I

研究人员首先建立了检测体系。他们使用还原型的2,3-二甲基-1,4-萘醌（DMNQH₂）作为甲基萘醌（MQH₂）的类似物，分别测量了分离纯化的CIII₂CIV₂超复合体和细胞色素bd-I的氧化活性（以氧气消耗速率表示）。结果表明，CIII₂CIV₂超复合体在100 μM DMNQH₂时达到最大活性，约为80 s^-1。而细胞色素bd-I在300 μM DMNQH₂时的活性为18 s^-1。

Activities of isolated CIII₂CIV₂and cytochrome bd-I in the presence of decylubiquinone

关键的抑制实验发现，当使用还原型去甲苯醌（DCQH₂）作为底物时，CIII₂CIV₂超复合体的活性极低（≤ 2 s^-1），而细胞色素bd-I的活性则低至无法检测。更重要的是，当在DMNQH₂存在下加入DCQH₂时，两者活性均受到显著抑制。对于CIII₂CIV₂超复合体，随着DCQH₂浓度增加，其活性呈剂量依赖性下降，半抑制浓度（IC₅₀）约为60 μM。对于细胞色素bd-I，在饱和浓度的DCQH₂（约20 μM）存在下，其活性仍能维持在大约10 s^-1，约为最大活性的42%，表明抑制程度相对较轻，但确实存在。

Modulation of DCQH₂inhibition by engineering the Q_osite

为了验证DCQH₂的抑制作用是否通过结合在CIII₂的醌氧化位点（Q_osite）实现，研究人员使用了一个CIII₂的Q_o位点三重突变体（QcrB亚基的M337A, M305A, F153A突变，简称AAA突变体）。该突变体的超复合体活性约为野生型的60%。抑制实验显示，AAA突变体的IC₅₀从野生型的约70 μM升高到约130 μM，这表明改变Q_o位点的结构特性会影响DCQH₂的抑制效力，间接支持了DCQH₂作用于Q_o位点的观点。

Reduced growth of M. smegmatis in the presence of DCQ

抑制酶活性的最终目的是影响细菌生长。在固体LB培养基上，添加DCQ显著损害了耻垢分枝杆菌的生长，而添加同等浓度的DMNQ仅在较高浓度（50 μM）且高稀释度下才观察到轻微的生长受损。这直接证明了DCQ具有抑制分枝杆菌生长的能力。

Reduced growth of virulent M. tuberculosis cells in human macrophages upon treatment with DCQ

研究最具临床相关性的发现在于，DCQ同样能够抑制致病性结核分枝杆菌H37Rv在人原代巨噬细胞内的生长。高内涵成像分析显示，与未处理的感染对照组相比，DCQ处理（50 μM和250 μM）可导致53-64%的细菌生长抑制，且呈剂量依赖性。相比之下，DMNQ处理反而促进了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长。流式细胞术分析进一步证实了DCQ在48小时内即可抑制巨噬细胞内减毒株H37Ra-GFP的生长。值得注意的是，较高浓度的DCQ（250 μM）和DMNQ（50 μM及以上）会引起巨噬细胞形态改变（变圆、皱缩），提示潜在的细胞毒性，但在较低且有效的DCQ浓度下（25-50 μM），细胞形态得以保持，表明其抑制作用具有选择性窗口。

Cryo-EM structure of the CIII₂CIV₂supercomplex with bound DCQ

为了在原子水平上揭示DCQ的作用机制，研究人员解析了DCQH₂处理后的CIII₂CIV₂超复合体的冷冻电镜结构，整体分辨率达到2.5 ?。结构清晰地显示，在CIII₂二聚体的每个Q_o位点存在醌类分子的密度。有趣的是，在一个单体中，密度更符合添加的DCQ，而在另一个单体中则更接近内源性的MQ。DCQ结合在Q_o位点中距离铁硫簇（FeS）较远的Q_o1b位置，这与之前观察到的内源性MQ的结合位置相同。DCQ的芳香环头部指向Q_o1a位置，脂肪族长尾伸向膜区。研究人员推测，DCQ之所以产生抑制作用，是因为它竞争性地占据了MQH₂的结合位点（Q_o1b），但由于其化学结构或电化学性质的差异，可能无法有效地移动到进行电子转移所必需的Q_o1a位置，或者无法正确取向以将电子传递给FeS中心。与已知的Q_o位点抑制剂如兰索拉唑硫化物（LPZS）和Q203（Telacebec）相比，DCQ的结合位置与它们部分重叠，但后者能更彻底地阻断整个Q_o位点腔。

总结与讨论

本研究通过严谨的实验证据表明，去甲苯醌（DCQ）能够有效抑制分枝杆菌分支呼吸链的两个关键终端氧化酶——CIII₂CIV₂超复合体和细胞色素bd-I的活性。其作用机制在于DCQ竞争性地结合于CIII₂的Q_o位点，干扰了内源性甲基萘醌（MQ）的正常功能。这种双重抑制作用最终转化为对耻垢分枝杆菌体外生长和结核分枝杆菌在巨噬细胞内增殖的显著遏制。

该研究的重大意义在于为抗结核药物研发提供了新的思路和候选分子。鉴于分枝杆菌呼吸链的冗余性，同时靶向CIII₂CIV₂和细胞色素bd两条通路被认为是实现有效杀菌的关键策略。DCQ展现了这种双重抑制的潜力。虽然其体外抑制效力（IC₅₀）低于一些已进入临床研究的特异性抑制剂（如Q203），但其独特的作用模式（利用外源醌干扰内源醌代谢）和潜在的双重作用使其具有进一步开发的價值。特别是DCQ在巨噬细胞感染模型中表现出的有效性，提示它可能能够克服结核分枝杆菌在宿主细胞内所处的恶劣环境，直接作用于病原体。

此外，研究也引发了对DCQ或其类似物可能对宿主免疫细胞功能产生影响的思考。有研究表明，辅酶Q10（Coenzyme Q10）可以增强巨噬细胞的吞噬功能和抗菌活性。DCQ作为其类似物，在抑制细菌的同时，是否也能调节宿主免疫力，从而间接增强抗菌效果，是一个值得深入探讨的方向。当然，DCQ在较高浓度下对宿主细胞的潜在毒性也需要在后续研究中仔细评估，以确定其治疗窗口。

综上所述，这项研究不仅揭示了DCQ作为一种新型抗分枝杆菌先导化合物的潜力，更重要的是，它验证了“通过引入外源电子载体干扰分支呼吸链”这一创新策略的可行性。未来，通过结构指导的药物设计优化DCQ的效力和选择性，或将其与现有抗结核药物（如靶向ATP合酶的贝达奎琳Bedaquiline）联用，有望开发出更高效、不易产生耐药性的结核病治疗方案，为全球结核病防治事业贡献力量。