FgNR基因调控禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的生长、致病性以及对杀菌剂的敏感性

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：FgNR gene regulates growth, pathogenicity, and fungicide sensitivity in fusarium graminearum

镰刀菌黄萎病中硝酸盐还原酶基因FgNR的功能研究表明，其敲除突变体生长受限、致病性减弱且毒素合成减少，同时耐盐性增强，基因表达谱显示Tri5/Tri6下调而Tri10/FgCYP51A上调，揭示了FgNR在氮代谢、无性繁殖及抗逆性中的关键作用。

　　

Bingyang Hu | Mingcan Yin | Xuhao Guo | Jia Jiang | Le Qian | Kai He | Shengming Liu

河南科技大学园艺与植物保护学院，中国洛阳471023

摘要

Fusarium graminearum是导致赤霉病的主要病原菌，对粮食安全和农业发展构成严重威胁。在本研究中，我们利用基因敲除技术构建了FgNR（硝酸盐还原酶基因）敲除突变体及其互补突变体，以探讨FgNR的生物学功能。实验结果表明，FgNR的缺失显著降低了F. graminearum的生长速率和分生孢子萌发率。敲除突变体无法在仅含有硝酸盐的基本培养基上生长，而野生型和互补突变体则能正常生长。在NaCl和KCl胁迫下，ΔFgNR的生长速率有所提高。此外，ΔFgNR的细胞膜和细胞壁完整性受损，对外部氧化剂的耐受性降低，其致病性也显著减弱，同时脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的产量减少。Tri5和Tri6基因的表达水平下调，而Tri10基因的表达水平上调。与野生型相比，敲除突变体对丙环唑的敏感性降低，FgCYP51A基因的表达显著增强。这些发现表明FgNR在F. graminearum的无性繁殖、致病性、氮源利用以及对非生物胁迫和杀菌剂的敏感性中起着关键作用。

引言

由F. graminearum引起的赤霉病是一种严重影响小麦生产的毁灭性真菌病害。该病原菌主要在中国黄河流域和长江中下游地区流行。该病害最早于19世纪末在英国被描述（Champeil等人，2004年）。除了F. graminearum外，引起赤霉病的病原菌还包括F. avenaceum和F. asiaticum（Liu等人，2020b；Liu等人，2020a）。赤霉病可以在小麦生长的整个阶段发生，其中开花期（花期）对Fusarium病原体的感染最为敏感（Osborne和Stein，2007年）。通过空气和雨水传播，病害在短距离内迅速扩散（Goswami和Kistler，2004年）。这种入侵过程会破坏麦穗的维管束，导致系统性感染，最终蔓延至整个麦穗（Gao等人，2018年）。赤霉病通过降低谷物品质并污染谷物中的霉菌毒素（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）而严重影响小麦的商业价值（Hao等人，2017年；Windels，2000年）。先前的研究表明，DON通过促进病原体侵入宿主组织和抑制植物防御机制来增强病原体的毒力（Alexander等人，2009年；Etzerodt等人，2015年）。目前，采用综合策略（包括化学控制、抗病育种、农业管理措施和生物控制）来管理赤霉病（Alisaac和Mahlein，2023年）。由于缺乏高度抗赤霉病的品种，化学控制仍是管理这种毁灭性小麦病害的主要方法（Dweba等人，2017年；Jiang等人，2019年）。

最近关于F. graminearum致病机制的研究取得了重要进展，主要集中在揭示其致病性和霉菌毒素生物合成的分子机制上。NPS6基因有助于F. graminearum从宿主植物中吸收铁，并使其对超氧自由基更加敏感（Oide等人，2006年）。FgFSR1基因调控F. graminearum的毒素产生和有性繁殖（Shim等人，2006年）。FgGEA1基因参与新形成的子囊壁结构调节（Son等人，2013年）。FgCrz1A基因调控菌丝发育。在敲除突变体中，菌丝生长速率降低，菌丝分支数量增加，致病性减弱，渗透耐受性增强（Chen等人，2019a）。

硝酸盐还原酶（NR）最初由Evans和Nason在1952年在Neurospora crassa中发现（Evans和Nason，1952年）。在催化过程中，NR将硝酸盐（NO?^?）还原为亚硝酸盐（NO?^?），随后亚硝酸盐再被亚硝酸盐还原酶（NiR）还原为铵（NH?⁺（Solomonson和Spehar，1977年）。生成的铵随后被吸收进入谷氨酸循环途径进行氮代谢（Stitt等人，2002年）。NR的合成和降解受到复杂的调控机制控制。硝酸盐是Aspergillus nidulans和N. crassa等真菌的重要氮源（Yamasaki和Sakihama，2000年）。Nrg1和Nrg2基因负调控真菌中与硝酸盐吸收相关的蛋白质的表达，包括硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和硝酸盐转运蛋白（Yamasaki和Sakihama，2000年）。在酵母和丝状真菌中，氮代谢由GATA转录因子家族AreA/NIT2调控（Campbell，1999年）。在F. graminearum中，FgAREA作为氮代谢抑制的调控因子。敲除FgAREA会抑制Tri5、Tri6和Tri10基因的表达，从而显著降低DON霉菌毒素的产量（Min等人，2012年）。NR是氮代谢中的限速酶，影响DON的生物合成（Yu等人，2014年）。然而，硝酸盐还原酶基因在Fusarium物种的致病性和毒力中的作用尚未得到充分研究。

因此，我们研究了F. graminearum中FgNR的生物学功能。系统分析表明FgNR调控着F. graminearum的关键生理过程。这些研究为发现新的杀菌剂靶点和开发控制赤霉病的新策略提供了理论基础。

菌株、培养基和杀菌剂

本研究从中国河南省安阳市的一个小麦生产区采集了F. graminearum的野生型AY1801菌株。常规培养使用马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA：200克马铃薯、20克蔗糖、每升蒸馏水15克琼脂），培养温度为25℃。使用的杀菌剂包括Phenamacril（2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸酯；C₁₂H₁₂N₂O₂；CAS：39491–78-6；有效成分浓度95%）和Carbendazim（甲基苯并咪唑-2-基氨基甲酸酯；C₉H₉N₃O_2RS）-1-p

FgNR基因序列及其在不同发育阶段的表达水平分析

FgNR（FgSG_01947）的编码序列（CDS）来自NCBI数据库，长度为2319 bp，编码一个含有772个氨基酸的蛋白质。实验结果表明，该蛋白质的分子量为86.89 kDa，理论等电点（pI）为6.01，脂肪族指数为77.55，不稳定性指数为34.40。研究还发现存在一个Cyt-b5结构域，位于416–488位残基之间（长度为73个氨基酸）（图1A）。

讨论

氮被誉为生命元素，在所有生物体的结构和功能完整性中起着关键作用。真菌能够吸收多种氮化合物，这些化合物统称为氮源。NH?和Gln通常是微生物首选的氮源。当这些主要氮源不足时，微生物会激活利用次级氮源的途径，如NO?^?、NO?^?、氨基酸和蛋白质（Arst和Cove，1973年）。

资助

本研究得到了洛阳 Commonwealth专项研究基金（资助编号：2302032A）和河南省自然科学基金（资助编号：232301420122）的支持。

CRediT作者贡献声明

Bingyang Hu：撰写初稿，数据整理。Mingcan Yin：数据整理。Xuhao Guo：正式分析。Jia Jiang：撰写、审稿与编辑。Le Qian：撰写、审稿与编辑。Kai He：撰写、审稿与编辑。Shengming Liu：撰写、审稿与编辑，撰写初稿，资源管理，项目规划，方法设计，研究实施，资金申请。

未引用的参考文献

Catlett等人，2003年 Lou等人，2018年

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。