星形介孔二氧化硅包裹的金纳米簇用于尿素酶及其抑制剂的灵敏检测

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Stellate Mesoporous Silica-Encapsulated Gold Nanoclusters for Sensitive Detection of Urease and Its Inhibitors

尿素酶及其抑制剂的荧光检测方法研究：通过空间限域效应和pH响应特性设计新型AuNCs@MSN纳米复合材料，显著提升荧光灵敏度达4倍以上，检测限低至4.02 U/L，并成功应用于真实唾液样本检测，展现良好的生物医学应用潜力。

　　

王梦军|杨新文|江琳|李俊|王梦珂

中国四川省成都市西华大学理学院化学系，邮编610039

摘要

尿酶活性的灵敏检测对于环境和生物分析至关重要。本文制备了一种新型的绿色发光微球（AuNCs@MSN），该方法将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶修饰的金纳米簇（ATT-AuNCs）封装在大型星形介孔二氧化硅纳米球（MSN）载体中，用于灵敏且选择性地监测尿酶及其抑制剂。MSN的空间限制效应以及封装的ATT-AuNCs的均匀分布有效减少了能量损失和自淬灭现象，使得AuNCs@MSN的荧光强度比游离的ATT-AuNCs提高了4倍以上。ATT-AuNCs表面配体的质子化或去质子化使其对环境pH值的变化具有较好的敏感性，这影响了表面分子内电荷转移（ICT）过程。基于AuNCs@MSN的pH响应特性开发的这种荧光传感器，能够检测到低至4.02 U/L的尿酶浓度。此外，该传感器还能成功检测到尿酶抑制剂，包括苯基磷酰胺（PPD）和敌百虫。更重要的是，在真实唾液样本中的测试结果表明，该传感器在检测尿酶活性方面表现优异，显示出其在生物医学应用中的巨大潜力。

引言

尿酶存在于生物体、植物和某些无脊椎动物中，是一种普遍存在的酶，能够特异性催化尿素水解为氨（NH?）和二氧化碳（CO?），从而提高介质的pH值[1]。例如，在农业中，土壤中尿酶活性的升高可能会导致尿素过度水解，释放出对作物和环境有害的氨[2][3]。在人体内，细菌尿酶的过度表达可能引发多种泌尿系统疾病，如感染性肾结石、肾盂肾炎和尿石症[4][5]。这些机制通常通过尿酶抑制剂来平衡，后者可以直接阻断尿素的水解过程[6]。因此，监测尿酶活性及其抑制剂对于生物分析和环境安全至关重要。

目前已有许多方法用于尿酶的检测，包括电化学[7]、光电化学[8]、比色法[9]和荧光法[10]。在先进的检测技术中，荧光光谱法因其实时响应能力和对多种样品的高灵敏度识别而备受关注。高效传感器的开发在很大程度上依赖于有效荧光探针的开发。迄今为止，已经开发出了多种纳米探针，如有机荧光染料和金属有机框架（MOFs）。然而，这些探针往往存在毒性、溶解性差和制备过程耗时等固有缺点。

纳米簇（NCs）由于其低毒性、独特的光学性质和优异的生物相容性，在荧光检测中展现出巨大潜力[11]。将NCs与其他纳米材料结合形成杂化结构可以显著提升其性能，并扩大其在基于荧光的传感中的应用范围。例如，Jia等人[12]使用阳离子聚电解质PDDA作为桥接剂，将谷胱甘肽稳定的金纳米簇（GSH-AuNCs）嵌入介孔二氧化硅干凝胶中，从而改善了AuNCs的分散性并显著提高了其电致发光效率。最近，Liu团队[13]开发了具有强发光特性的Arg/ATT-AuNCs@ZIF-8复合材料，用于检测对硝基酚。在Arg/ATT-AuNCs@ZIF-8复合材料中，精氨酸（Arg）通过氢键固定了AuNCs上的ATT配体，减少了非辐射衰减路径，从而增强了荧光强度。此外，封装在ZIF-8中的纳米簇进一步放大了荧光信号。因此，合理设计高发光性的基于NC的杂化荧光纳米材料对其实际应用至关重要。

受这些研究的启发，我们创新性地利用了6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶修饰的金纳米簇（ATT-AuNCs）的空间限制效应，制备了荧光增强的纳米球（Scheme 1），为尿酶及其抑制剂的灵敏检测提供了新的荧光探针方法。这些微球（称为AuNCs@MSN）是通过将游离的ATT-AuNCs封装在大型星形介孔二氧化硅纳米球（MSN）载体中形成的，并额外添加了一层二氧化硅壳以增强稳定性。ATT-AuNCs表面配体的质子化或去质子化使其对pH值的变化具有敏感性，影响了表面分子内电荷转移（ICT）过程。尿酶催化的尿素水解生成CO?和氨，使溶液的pH值升高，从而显著增强了AuNCs@MSN的荧光强度。AuNCs@MSN良好的pH响应性能促使我们开发出一种灵敏的荧光传感器来检测尿酶及其抑制剂，即使在真实唾液样本中的测试结果也令人满意，展示了该传感平台在生物医学应用中的巨大潜力。

材料与设备

盐酸（HCl）、尿素和过氧化氢（H?O?，30%）均购自凯龙试剂有限公司（成都，中国）。蔗糖（Sur）、葡萄糖（Glu）、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶（ATT）、敌百虫、苯基磷酰胺（PPD）和尿酶均购自默克化学技术有限公司（上海，中国）。单分散介孔二氧化硅纳米球（MSN）购自南京XFNANO材料科技有限公司。氯金酸（HAuCl?·4H?O）购自Sigma公司

AuNCs@MSN的表征

绿色发光微球AuNCs@MSN是通过带正电的MSN与带负电的ATT-AuNCs之间的静电相互作用合成的（图1）。MSN的空间限制效应、较大的比表面积以及封装的ATT-AuNCs的均匀分布显著增强了AuNCs@MSN的荧光强度，而二氧化硅壳层则提高了其稳定性。MSN和AuNCs@MSN的形态和组成通过扫描电子显微镜进行了表征

结论

总之，通过将ATT-AuNCs封装在MSN中，成功合成了具有增强荧光性能和稳定性的新型绿色发光AuNCs@MSN纳米复合材料。ATT-AuNCs表面ATT分子的质子化，结合MSN的空间限制效应，使得AuNCs@MSN能够对环境pH变化产生显著的荧光响应。AuNCs@MSN对pH变化的高敏感性被有效利用，开发出了灵敏的检测方法

作者贡献声明

李俊：可视化、验证、数据分析。王梦珂：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、数据分析。杨新文：撰写——初稿撰写、软件使用、数据管理、概念构思。江琳：软件使用、方法设计、数据管理、概念构思。王梦军：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、资金申请、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。本手稿的提交不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了西华大学人才启动计划（Z222053）的支持。

王梦军是中国西华大学的博士，2022年获得吉林大学理学博士学位。她的研究方向包括纳米材料的合成、表征、功能化及其在生物传感器中的应用。