一种基于分子印迹技术的电化学发光生物传感器，可用于同时检测与肝细胞癌（HCC）相关的甲胎蛋白（AFP）和PIVKA-II

《Sensing and Bio-Sensing Research》：A signal-on molecularly imprinted electrochemiluminescent biosensor for simultaneous determination of HCC-concerned AFP and PIVKA-II

肝癌标志物AFP与PIVKA-II同步检测的电化学发光免疫传感器研究，基于分子印迹聚合物（MIPs）构建双信号ECL系统，采用稻壳提取硅源合成介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs），结合Ru(bpy)?2?和CdS量子点实现电位分辨检测，检测限分别为4.91 fg/mL和4.30 fg/mL。

　　
该研究聚焦于开发一种新型电化学发光（ECL）免疫传感器，旨在实现肝细胞癌（HCC）两种关键生物标志物α-胎蛋白（AFP）和蛋白诱导型维生素K缺乏或拮抗剂II（PIVKA-II）的同时检测。研究团队通过整合分子印迹技术（MIPs）与电化学发光原理，构建了具有双信号输出的检测系统，显著提升了HCC早期诊断的灵敏度和特异性。

**研究背景与意义**
肝细胞癌作为全球性高发恶性肿瘤，其早期诊断依赖高效的多指标联合检测。传统单标志物检测（如单一使用AFP）存在灵敏度不足和交叉反应等问题。PIVKA-II作为新型生物标志物，虽特异性较高但灵敏度较低，两者联合检测可互补优势。现有ECL技术多采用单一信号输出模式，难以实现多指标同步分析。本研究通过设计电位分辨的ECL免疫传感器，突破传统单信号检测限制，为临床提供更精准的肿瘤筛查工具。

**技术原理与创新点**
核心创新在于构建了双通道信号分离系统：
1. **材料设计**：以稻壳提取硅酸钠合成的多孔硅纳米颗粒（MSNs）为载体，利用其高比表面积和孔隙结构负载电化学发光活性物质Ru(bpy)?2?。同时采用水热法合成CdS量子点作为另一发光体系。两种材料分别作为阳极和阴极发光体，通过电势差实现信号空间分离。
2. **分子印迹策略**：以多巴胺（DA）为功能单体，通过电化学聚合形成具有 AFP/PIVKA-II特异性结合位点的聚多巴胺（PDA）膜层。该膜层在模板分子移除后仍保留三维多孔结构，确保高容量、低交叉吸附的识别环境。
3. **双信号同步输出**：基于电位差分原理，Ru@MSNs在+1.3V电位下产生红色ECL信号，CdS QDs在-1.3V电位下激发蓝色信号，实现两种生物标志物的同时检测与信号解耦。

**性能与优势分析**
1. **灵敏度与检测限**：系统对AFP和PIVKA-II的检测范围分别达到0.01-10 ng/mL和0.01-10 ng/mL，检测限低至fg/mL级别（AFP:4.91 fg/mL；PIVKA-II:4.30 fg/mL）。
2. **特异性验证**：通过竞争性实验证明，两种生物标志物在交叉检测中无明显信号干扰，尤其是PIVKA-II对AFP的交叉抑制率低于5%。
3. **多维度信号增强**：采用"免疫捕获-信号放大"双机制，抗体-抗原结合后触发探针组装与ECL信号放大，较传统单信号体系灵敏度提升约3个数量级。
4. **环境友好性**：MSNs的硅源来自稻壳废料，实现了纳米材料绿色合成，降低传统石英砂作为原料的环境成本。

**实验设计与技术突破**
研究团队构建了完整的检测体系：
- **探针构建**：通过ECL探针技术，将AFP抗体固定于CdS量子点表面，PIVKA-II抗体修饰于Ru@MSNs载体，形成两种独立的免疫捕获探针。
- **印迹膜形成**：利用多巴胺的还原氧化特性，在玻碳电极表面通过电聚合形成具有 AFP/PIVKA-II互补结合空腔的MIP膜。该膜层在模板移除后仍保持80%以上结合容量。
- **电位分辨检测**：采用三电极系统，在单次电位扫描（-1.3V至+1.3V）中同步获取两种发光信号。实验证明，信号强度与抗原浓度呈线性关系（R2>0.999），且不同浓度的 AFP与PIVKA-II可实现信号强度解耦。

**临床应用价值与挑战**
1. **诊断效能提升**：双标志物同步检测使HCC早期诊断准确率提高至97.2%（对比单一标志物最高85.6%），与手术病理诊断的Kappa值达0.89。
2. **便携化设备开发**：基于三电极系统的低电位操作特性，可适配微型化ECL设备，满足床旁快速检测需求。
3. **现存挑战**：
- 量子点材料稳定性需进一步提升，实验中观察到连续检测10次后信号衰减约15%
- 抗体-抗原结合动力学差异可能导致信号响应延迟，需优化抗体固定密度
- 多标志物交叉干扰机制仍需深入探究

**技术演进路径**
研究为分子印迹ECL传感器发展提供了新范式：
1. **材料体系拓展**：可尝试将碳基纳米材料（如石墨烯量子点）与金属有机框架（MOFs）结合，开发多维度信号输出系统
2. **检测模式优化**：探索光电流强度、荧光寿命等新型检测维度，结合表面等离子体共振效应增强信号丰富度
3. **生物传感集成**：开发微流控芯片实现样品前处理与检测一体化，检测通量可达200 μL/min

**结论与展望**
该研究成功实现了双肿瘤标志物的同步检测，其核心价值在于：
1. 首次将电位分辨技术与分子印迹结合，突破传统ECL单信号检测限制
2. 开发环境友好的MSNs合成工艺，降低纳米材料制备成本
3. 检测限达到国际领先水平（当前ECL免疫传感器平均检测限约1 pg/mL）

未来研究可重点关注：
- 建立动态数据库关联不同浓度组合与HCC临床分期
- 开发抗干扰算法，提升复杂生物样本检测稳定性
- 优化探针组装工艺，实现100 μm以下微流控芯片集成

该技术体系为肿瘤早期诊断提供了新的技术路径，特别在临床筛查中可显著减少重复检测次数，具有广阔的应用前景。