基于脑源性细胞外囊泡蛋白质组学揭示坎地沙坦对帕金森病患者的神经保护作用

《npj Parkinson's Disease》：Brain-derived extracellular vesicle proteomics reveals neuroprotection induced by the ARB candesartan in Parkinson’s disease patients

本研究针对帕金森病（PD）缺乏直接分子证据证明血管紧张素II 1型受体（AT1）阻滞剂（ARBs）神经保护作用的难题，通过分离帕金森病患者血清中神经元、小胶质细胞/巨噬细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞来源的细胞外囊泡（EVs）并进行蛋白质组学分析，首次在患者体内证实ARB类药物坎地沙坦能诱导关键蛋白表达改变，涉及氧化应激、蛋白稳态、神经炎症等多个与多巴胺能神经元退行性变相关的通路，为ARBs的神经保护作用提供了直接分子证据，支持其老药新用于帕金森病神经保护治疗的临床试验。

　　

在探索对抗神经退行性疾病的征程中，帕金森病（Parkinson's Disease, PD）始终是科学家们攻坚的重点。这种疾病以大脑中负责协调运动的多巴胺能神经元进行性丧失为主要特征，导致患者出现震颤、僵硬、运动迟缓等一系列症状。尽管现有的治疗手段能在一定程度上缓解症状，但能够延缓或阻止疾病进展的神经保护疗法仍然匮乏。近年来，一个令人兴奋的线索逐渐浮出水面：一类常用于治疗高血压的药物——血管紧张素II 1型受体阻滞剂（Angiotensin II Type-1 Receptor Blockers, ARBs），在大量动物实验和流行病学研究中显示出降低帕金森病风险的潜力。然而，一个关键问题悬而未决：这些在实验模型中观察到的有益效果，是否真的能在帕金森病患者的大脑中发生？由于直接获取活体人脑组织进行分子研究存在巨大困难，这个问题一直缺乏确凿的证据。

正是在这一背景下，由Laura Camacho-Meno、Carmen M. Labandeira、Ana I. Rodriguez-Perez等领导的研究团队开展了一项创新性的研究。他们巧妙地利用了一种名为"细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）"的天然信使。这些微小的膜泡由细胞释放，能够穿越血脑屏障进入血液循环，其携带的蛋白质、核酸等"分子货物"忠实地反映了来源细胞的生理和病理状态。研究人员设想，能否通过分析帕金森病患者血液中不同脑细胞（如神经元、星形胶质细胞等）来源的EVs的蛋白质组成，来间接"窥探"ARB药物对患者大脑产生的分子影响？

为了验证这一设想，研究团队从一项为期28周的随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验中，随机选取了5名帕金森病患者。这些患者在试验期间服用了能够透过血脑屏障的ARB药物——坎地沙坦（candesartan）。研究人员分别在他们开始治疗前和治疗6个月后采集了血液样本。接下来，他们建立了一套精密的分离技术：首先从血清中提取总EVs，然后像"精确制导"一样，使用针对特定细胞表面标志物的抗体，依次分离出神经元来源的EVs（nEVs，使用L1CAM/CD171抗体）、星形胶质细胞来源的EVs（aEVs，使用GLAST抗体）、少突胶质细胞来源的EVs（oEVs，使用MOG抗体）以及小胶质细胞/巨噬细胞来源的EVs（m/mEVs，使用TMEM119抗体）。他们对这些分离得到的EVs进行了严格的鉴定，包括纳米颗粒追踪分析（NTA）其粒径和浓度、透射电子显微镜（TEM）观察其形态，并通过ELISA（酶联免疫吸附测定）检测其特异性标志蛋白（如神经元的NSE、星形胶质细胞的GFAP等），以确保所获EVs的纯度和细胞来源特异性。研究的核心是采用一种名为"顺序窗口采集所有理论碎片离子质谱（Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragment ion spectra Mass Spectrometry, SWATH-MS）"的高通量蛋白质组学技术，对治疗前后四种脑细胞来源的EVs中的蛋白质表达进行精准定量和比较分析。

患者特征

本研究分析的5名患者来自一项关注认知障碍的临床试验，该试验显示坎地沙坦对改善帕金森病患者常见的冷漠症状有积极作用。在本研究涉及的患者中，部分患者运动功能评分（UPDRS III）有改善，但未达到临床显著差异。情绪评分（HADS）的变化也需谨慎解读。所有患者入组时无显著心血管疾病，坎地沙坦治疗未引起有临床意义的血压变化或导致治疗中断的不良事件。

所获细胞外囊泡的表征

纳米颗粒追踪分析和透射电子显微镜证实了分离的EVs具有典型的囊泡形态和尺寸（平均直径约115-119纳米），且治疗前后无显著差异。ELISA检测显示总EVs富含CD81、CD63和Alix等经典EV标志物，而内质网标志物Calnexin未被检测到，证明了EV制品的纯度。更重要的是，针对四种脑细胞特异性标志物（NSE, GFAP, MBP, IBA-1）的定量ELISA显示，经过免疫亲和捕获后的相应EV亚型中，这些标志物含量显著高于血清和总EVs，且在其他非对应EV亚型中含量极低，成功验证了神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞来源EVs的特异性分离。

分离的EVs中失调蛋白与脑组织相关

SWATH-MS蛋白质组学分析共鉴定出1141种蛋白质，其中874种被定量。生物信息学分析（STRING）确认大多数定量蛋白与脑组织相关，支持了这些EVs的中枢神经系统起源。

坎地沙坦诱导的神经元来源EVs中的蛋白变化

在神经元来源的EVs（nEVs）中，坎地沙坦治疗导致46种蛋白表达失调（19种上调，27种下调）。显著上调的蛋白包括PARK7/DJ-1（一种重要的抗氧化蛋白和帕金森病相关蛋白）、TCPZ（分子伴侣复合物亚基，有助于抑制α-突触核蛋白聚集）、FUS（参与RNA代谢和DNA修复）等，这些变化提示神经元增强了抗氧化能力、线粒体保护、蛋白稳态维持和基因调控。显著下调的蛋白包括HS90B（HSP90B1，内质网应激伴侣蛋白）、DEST（Destrin，参与细胞骨架动态调节，其过度激活会加剧α-突触核蛋白病理）等，表明内质网应激、细胞骨架不稳定性和氧化应激减轻。蛋白质相互作用网络和基因本体论分析揭示了这些失调蛋白在蛋白折叠、细胞应激反应、细胞粘附、能量代谢和核酸结合等关键分子功能上的富集。这些变化共同指向坎地沙坦触发了协调的神经保护反应，改善了神经元的氧化还原状态、线粒体功能、蛋白稳态，并减轻了突触、代谢和炎症应激。

坎地沙坦诱导的星形胶质细胞来源EVs中的蛋白变化

在星形胶质细胞来源的EVs（aEVs）中，发现22种蛋白表达失调（10种上调，12种下调）。上调蛋白如PSB4（蛋白酶体亚基）和LSAMP（参与突触形成）提示星形胶质细胞的蛋白降解能力和对神经连接的支持增强。下调蛋白如SUMO2（一种在氧化和蛋白毒性应激下被激活的修饰蛋白）和CRNS1（可能消耗抗氧化剂肌肽）则反映了氧化应激和蛋白毒性应激的减轻。这些变化表明坎地沙坦促使星形胶质细胞向一种更支持性、低应激的表型转变，有助于为神经元创造一个更有利的微环境。

坎地沙坦诱导的少突胶质细胞来源EVs中的蛋白变化

在少突胶质细胞来源的EVs（oEVs）中，观察到92种蛋白表达失调（47种上调，45种下调），是变化最丰富的细胞类型。上调蛋白涉及微管稳定（如TBCB）、脂质代谢（如APOC3）、RNA处理（如DHX9）和线粒体功能（如ATP5H），提示少突胶质细胞在髓鞘修复、代谢支持和细胞应激反应方面被激活。下调蛋白包括KLKB1（可能参与神经炎症）和CLIC4（与神经炎症和脱髓鞘过程相关），表明神经炎症反应减弱和胶质稳态恢复。这些蛋白变化共同指向坎地沙坦增强了少突胶质细胞的保护性功能，可能通过改善髓鞘完整性、代谢支持和控制神经炎症来支持神经元健康。

坎地沙坦诱导的小胶质细胞/巨噬细胞来源EVs中的蛋白变化

在小胶质细胞/巨噬细胞来源的EVs（m/mEVs）中，发现48种蛋白表达失调（23种上调，25种下调）。上调蛋白如NSFL1C（p47）和PPP1R7（SDS22）是已知的促炎信号通路（如NF-κB）负调控因子，其增加提示小胶质细胞向抗炎、修复表型转变。SNAP25（一种突触蛋白）在m/mEVs中的出现可能暗示小胶质细胞对突触物质的清除和重塑活动增强。下调蛋白如ODO1（线粒体酶，是活性氧来源）和HSP72（可作为损伤相关分子模式分子激活炎症）的减少，则反映了小胶质细胞线粒体氧化应激和炎症激活状态的减轻。这些变化一致表明坎地沙坦促进了小胶质细胞向一种稳态的、神经保护性的表型转化，有助于减轻神经炎症并支持神经元存活。

讨论与结论

本研究首次采用基于血液脑源性细胞外囊泡蛋白质组学的微创策略，在帕金森病患者体内直接证明了口服ARB类药物坎地沙坦能够引发大脑中神经元和各种胶质细胞广泛的分子改变。这些改变影响了与帕金森病进展密切相关的关键生物学过程，包括氧化应激、内质网应激、线粒体功能障碍、蛋白稳态失调、神经炎症以及突触功能等。特别值得注意的是，研究不仅证实了ARBs对神经元的保护作用，还揭示了它们对星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞功能的显著调节，这表明胶质细胞在ARBs的神经保护效应中扮演着主动且重要的角色。

研究结果与大量临床前研究的发现高度一致，这些研究已证实ARBs通过抑制NADPH氧化酶介导的氧化应激、小胶质细胞介导的神经炎症、调节线粒体功能、抑制α-突触核蛋白聚集等机制，在多巴胺能神经元退化模型中发挥保护作用。本研究将这些机制从实验模型延伸至人类患者，为ARBs的神经保护作用提供了强有力的直接分子证据。

尽管本研究存在治疗时间相对较短（6个月）和样本量有限的局限性，但其创新性的方法和明确的阳性结果具有重要的科学和临床意义。它建立了一个强大的平台，可用于未来大规模临床试验中监测药物对大脑的分子效应。更重要的是，该研究为推进ARBs（尤其是能透过血脑屏障的品种，如坎地沙坦）作为帕金森病疾病修饰疗法的"老药新用"策略提供了关键的科学依据，强调了开展更大规模临床试验以评估其延缓帕金森病进展潜力的紧迫性和合理性。