亚甲蓝光动力疗法高效清除小儿穿孔性阑尾炎耐药菌：一项临床前研究

《Scientific Reports》：Photodynamic therapy with methylene blue effectively kills antibiotic resistant bacteria from pediatric patients with perforated appendicitis

本刊推荐：为解决小儿穿孔性阑尾炎(PA)术后因抗生素耐药菌感染导致住院时间长、负担重的问题，研究人员开展了亚甲蓝光动力疗法(MB-PDT)体外杀菌效果研究。结果表明，MB-PDT对临床分离的E. coli和S. anginosus可实现>5 log10的杀灭效果，且不受抗生素耐药性影响，为PA的辅助治疗提供了新策略。

　　

在儿科急腹症中，阑尾炎堪称“头号杀手”。而当病情进展为更严重的穿孔性阑尾炎(Perforated Appendicitis, PA)时，情况就变得棘手得多。大约每四个患病儿童中就有一个会遭遇PA，这意味着阑尾已经破裂，含有大量细菌的肠道内容物泄漏到腹腔，极易引发严重的腹腔感染和脓肿。与简单的阑尾炎相比，PA带来的是一连串的麻烦：医疗费用飙升、住院时间大幅延长（平均可达5到15天），术后恢复过程也更曲折。这一切的根源，很大程度上在于腹腔内那些“顽固”的细菌。传统的应对武器——抗生素，正面临着越来越严峻的挑战，因为从这些感染灶中分离出的细菌，特别是大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)，常常显示出对抗生素的耐药性。这使得医生们不得不使用更强效或更长时间的抗生素治疗，不仅增加了副作用的风险，也给患儿家庭和医疗系统带来了沉重的负担。有没有一种方法，能够绕过细菌的耐药机制，直接、高效地清除这些致病菌，从而改变PA的治疗困境呢？

一项发表在《Scientific Reports》上的最新研究，将目光投向了光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)这一新兴领域。PDT的原理颇具巧思：它利用一种被称为光敏剂(Photosensitizer)的药物，这种药物能够特异性地聚集在靶细胞（如细菌或肿瘤细胞）中。当用特定波长的光照射时，光敏剂会发生光化学反应，产生大量具有强大杀伤力的活性氧物种(Reactive Oxygen Species, ROS)。这些活性氧能迅速破坏细菌的细胞膜、蛋白质和DNA，导致其死亡。最关键的优势在于，这种物理化学性的杀伤机制与抗生素的作用靶点完全不同，因此即使是对多种抗生素耐药的“超级细菌”，也难以招架PDT的攻击，并且不易产生耐药性。在众多光敏剂中，亚甲蓝(Methylene Blue, MB)尤为引人注目，因为它本身就是一种被美国FDA批准用于治疗高铁血红蛋白血症的成熟药物，其人体安全性已有充分保障。此前的研究已证实MB-PDT对多种细菌有效，但尚未系统评估其对直接从PA患儿腹腔感染灶中分离出的临床菌株的杀伤效果。由于临床菌株的特性可能与实验室标准菌株存在差异，这项针对“真实世界”病原体的研究，对于推动PDT走向临床应用至关重要。

基于此，研究团队提出了一个明确的科学假设：对于从PA患儿腹腔液中分离出的浮游状态（单个游离的）细菌，MB-PDT能够在体外实现至少99.9%（即3 log₁₀）的杀灭效果。为了验证这一假说，他们开展了一项严谨的临床前基础研究。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几个关键技术方法：首先，在获得伦理批准和知情同意后，从30名经手术确诊为PA的儿科患者体内，按照标准临床程序采集腹腔液样本，并送至临床微生物实验室进行细菌鉴定和抗生素敏感性测试。其次，将分离出的特定细菌（如E. coli, Streptococcus anginosus group, Pseudomonas aeruginosa）在实验室中进行浮游单菌培养。核心的光动力治疗过程包括：将细菌与亚甲蓝(MB)共孵育，然后使用波长为665纳米的激光进行照射，设定的光剂量为7.2 J/cm²。最后，通过系列稀释涂布法计算处理后存活的细菌菌落数，从而精确量化MB-PDT的杀菌效果（以log₁₀减少值表示），并与未处理、仅加MB、仅照光等对照组进行统计学比较。

结果

细菌分离情况

研究共收集了30名患儿的样本，平均年龄为8.4岁。细菌培养结果显示，高达93.3%（28例）的样本中分离出了细菌，其中86.7%（26例）为多种细菌混合的 polymicrobial（多种微生物）感染，这凸显了PA感染的复杂性。最常见的细菌种类包括：大肠杆菌(E. coli)（出现于73.3%的患者）、咽峡炎链球菌群(Streptococcus anginosus group)（60.0%）、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)（46.6%）和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)（26.7%）。

抗生素耐药性

对分离菌株的抗生素敏感性分析揭示，耐药现象相当普遍，尤其是在E. coli中。例如，56%的E. coli菌株对氨苄西林耐药，40%对氨苄西林-舒巴坦耐药，32%对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑耐药。值得注意的是，对于S. anginosus group，由于医院常规不进行药敏试验，大部分菌株（77.8%）缺乏药敏数据，但在有数据的菌株中，也发现了对克林霉素的耐药。铜绿假单胞菌则主要对庆大霉素（75%耐药）和美罗培南（12.5%耐药）显示出耐药性。这些数据描绘了PA患儿腹腔感染菌株严峻的耐药背景。

PDT对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的总体效果

研究人员首先评估了MB-PDT对所有53个分离菌株的整体效果。结果显示，与未处理对照组相比，单独使用MB（不加光照）会导致细菌量出现一定程度的下降，而单独使用激光照射则几乎没有效果。然而，当MB和激光联合应用（即MB-PDT）时，产生了极其显著的杀菌效果，平均杀灭了5.72 log₁₀的细菌，远超预设的3 log₁₀成功阈值。当把细菌按革兰氏染色性质分类后，MB-PDT对15株革兰氏阳性菌（主要为S. anginosus group）和38株革兰氏阴性菌（包括E. coli和P. aeruginosa）均表现出强大的杀伤力，分别实现了5.72 log₁₀和4.92 log₁₀的减少。

PDT对不同细菌物种的效果

针对最主要的几种病原体，研究人员进行了更细致的分析：

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  对于大肠杆菌(E. coli)：MB-PDT处理27株E. coli后，取得了平均5.86 log₁₀的惊人杀菌效果，意味着每毫升样品中只剩下极少数存活细菌。
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  对于咽峡炎链球菌群(S. anginosus group)：针对17株S. anginosus，MB-PDT同样表现卓越，平均杀灭了5.91 log₁₀的细菌，几乎达到完全清除。
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  对于铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)：与E. coli和S. anginosus相比，9株P. aeruginosa对MB-PDT的反应有所不同，虽然也观察到了显著的2.23 log₁₀杀菌效果（即杀灭99.4%的细菌），但其平均杀菌程度低于3 log₁₀的阈值，并且不同菌株间的效果差异较大。为了探究是否可以通过增加光剂量来提升对P. aeruginosa的效果，研究人员挑选了两株效果不佳的菌株，尝试将光剂量提高至14.4 J/cm²和28.8 J/cm²，但结果发现增加光剂量并未能显著增强杀菌效果。这表明P. aeruginosa对MB-PDT的相对耐受性可能与其菌株特有的特性（如产生色素等）有关，而非简单的剂量不足。

PDT对抗生素耐药菌和敏感菌的效果比较

一个关键问题是，MB-PDT是否能同样有效地对付那些让临床医生头疼的耐药菌？分析结果带来了好消息：无论是E. coli、S. anginosus group还是P. aeruginosa，MB-PDT对抗生素耐药菌株的杀菌效果，与对抗生素全敏感菌株的效果相比，均无统计学差异。这意味着，细菌是否对抗生素耐药，并不影响它们对MB-PDT的敏感性。这为PDT作为克服抗生素耐药性的新策略提供了强有力的实验证据。

讨论与结论

这项研究首次系统地证实了亚甲蓝光动力疗法(MB-PDT)对于直接从小儿穿孔性阑尾炎(PA)患者腹腔感染灶中分离出的临床菌株具有强大的杀菌能力。研究结果有力地支持了其初始假设：对于浮游状态的E. coli和S. anginosus group，MB-PDT不仅能轻松达到超过99.9%（3 log₁₀）的杀灭目标，更是实现了接近99.999%（约5-6 log₁₀）的极高杀菌率。尤为重要的是，这种卓越的杀菌效果不受细菌抗生素耐药性状况的影响，为解决日益严重的耐药菌感染问题开辟了新的途径。

尽管MB-PDT对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的效果相对较弱且变异性较大，但这提示未来可能需要针对此类细菌优化PDT参数（如探索不同的光敏剂或联合策略）。本研究采用的较低光剂量（4 mW/cm²的功率密度和7.2 J/cm²的能量密度）相比文献中常见的高剂量更为温和，这在实际临床应用中（如对大面积腹腔进行光照）具有明显的优势，因为它降低了治疗的技术难度和潜在风险。

基于这些令人鼓舞的体外实验结果，以及研究团队此前在成人腹盆腔脓肿患者中成功进行的MB-PDT一期临床试验（该试验证明了治疗的安全性和初步有效性），研究者对未来临床应用提出了展望。他们设想，在因PA或憩室炎等需要进行腹腔镜手术时，可以在术中向腹腔内灌注亚甲蓝，随后通过腹腔镜器械导入光纤进行全腹腔照射。这种辅助治疗有望在手术清除感染源的同时，大幅降低腹腔内残留的细菌负荷，从而可能减少术后腹腔脓肿的形成，缩短静脉抗生素使用时间和住院天数，最终改善患儿预后，减轻医疗负担。

当然，将MB-PDT真正应用于PA的临床治疗仍面临一些挑战，例如需要进一步研究其在 polymicrobial（多种微生物）混合感染、生物膜(Biofilm)状态以及厌氧菌环境下的效果，并优化治疗参数。但毫无疑问，这项研究为改变当前PA的治疗范式提供了坚实的科学依据和充满希望的新方向。它标志着光动力疗法这一新兴技术，在对抗腹腔感染，特别是耐药菌感染的战场上，迈出了关键而坚实的一步。