靶向VEGFR-2抗血管生成：老药新用探索上市唑类药物作为乳腺癌治疗新策略

《Scientific Reports》：Exploring market-approved azoles as potential breast cancer therapeutics targeting the VEGFR-2 biotarget

本研究针对乳腺癌治疗中药物耐药性、选择性差及毒副作用大等难题，通过药物重定位策略，聚焦血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)这一关键血管生成调控靶点。研究人员采用分子对接、分子动力学模拟结合体外细胞实验（MTT法、VEGFR-2激酶抑制试验）及体内小鼠实体埃利希癌(SEC)模型，系统评估了30种上市唑类药物的抗肿瘤潜力。结果表明，抗真菌药伊曲康唑(Itraconazole, ITR)能有效抑制VEGFR-2活性(IC50= 32.70 μM)，显著降低肿瘤体积(抑制率47.4%)并改善血常规参数，其作用机制与索拉非尼(Sorafenib)类似，为乳腺癌治疗提供了具有已知安全性谱的候选药物。

　　

癌症，这个复杂而致命的疾病，已成为全球第二大死因。据世界卫生组织报告，2022年全球新发癌症病例约2000万例，预计到2035年这一数字将翻倍。乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球女性死亡的主要原因。特别是在中东和北非(MENA)地区，乳腺癌占女性癌症发病率的25%和死亡率的20%。尽管手术、放疗和免疫治疗策略取得了显著进展，化疗仍然是癌症治疗的主要手段。然而，临床疗效常因耐药性、缺乏选择性和显著毒副作用而受限。因此，开发高效、创新且选择性强的疗法，能够抑制癌细胞增殖而不影响健康细胞，已成为缓解癌症负担的关键。

肿瘤的侵袭性武器之一是其从现有血管系统生成新血管的能力，这一过程被称为血管生成。血管生成是一个复杂的动态过程，涉及细胞、细胞外基质基序和可溶性因子之间的广泛相互作用。在生理条件下，如伤口愈合、月经周期和胚胎发育过程中，血管生成受到严格调控。然而，在癌症进展中，特别是在乳腺癌中，血管生成失调被认为是主要的驱动因素。肿瘤通过产生各种化学信号（包括生长因子、细胞因子和转录因子）来刺激血管生成。肿瘤血管生成对于向肿瘤生长输送营养和氧气至关重要，并在肿瘤转移中发挥重要作用。因此，抑制肿瘤血管生成成为开发有前景的癌症治疗策略的一个引人入胜的方向。

血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)是血管生成的关键调节因子。VEGFR-2是存在于内皮细胞表面的主要受体，是VEGF信号传导以介导血管生成过程和内皮细胞功能的主要靶点。VEGFA与VEGFR-2活性位点的显著结合导致受体二聚化，随后特定细胞内酪氨酸残基（如Tyr⁹⁵¹, Tyr¹⁰⁵⁴, Tyr¹⁰⁵⁹, Tyr¹¹⁷⁵和Tyr¹²¹⁴）发生反式磷酸化，从而激活下游信号级联反应，最终刺激血管舒张、血管生成、细胞增殖和存活。VEGFR-2在多种恶性肿瘤中异常表达，包括乳腺癌、卵巢癌和成人神经母细胞瘤。在乳腺癌中，VEGF-VEGFR2信号传导对于抑制凋亡和维持乳腺癌细胞的增殖能力至关重要。血管生成水平升高与乳腺癌患者生存率降低相关。因此，通过靶向VEGF-VEGFR2信号传导来干预这一过程的起始和进展，成为增强乳腺癌常规治疗策略的一个有吸引力的方法。

传统的药物发现和开发过程耗时漫长、成本高昂，且具有高损耗率。药物重定位作为一种前瞻性方法，因其在节省时间和成本以及利用已证实的药物动力学和安全性方面的优势而受到广泛关注。这种方法旨在为临床批准的药物发现新的靶点和应用，利用其副作用或未识别的治疗效应。例如，沙利度胺和雷洛昔芬的成功重定位就是很好的例证。

另一方面，含氮杂环化合物是开发新治疗药物的最有希望的候选者之一。在含氮杂环化合物中，唑类药物因其结构特性而成为一个有前景的药效团，这些特性使其能够模拟许多官能团，并验证了其作为生物电子等排体在新活性化合物开发中的广泛应用。唑类衍生物具有疏水和亲水特性，在不同位置具有极性部分。其独特的骨架具有适应性，允许引入各种功能基团，从而调节参与癌症疾病增殖的多种分子靶点。据报道，基于咪唑和三唑的唑类化合物是具有药理活性的化合物，在包括癌症在内的多种疾病的治疗中有许多应用。例如，已有报道称三唑基化合物衍生物和三唑杂合体能有效降低MCF-7乳腺癌细胞中的VEGFR2表达，通过阻断血管生成和抑制肿瘤生长发挥作用。

鉴于抑制VEGFR-2在癌症治疗中的重要作用以及有前景的药物重定位方法，本研究旨在对部分上市批准的唑类药物针对目标VEGFR-2进行全面的虚拟筛选。通过分子对接、分子动力学模拟、体外细胞毒性试验、VEGFR-2抑制试验以及体内动物模型验证，研究人员系统评估了这些药物的抗肿瘤潜力。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1) 分子对接与虚拟筛选：使用AutoDock Vina对30种上市唑类药物与VEGFR-2（PDB: 2WZD和3U6J）进行对接，评估结合亲和力和模式；2) 分子动力学模拟：利用GROMACS软件对伊曲康唑(ITR)-VEGFR-2复合物进行200 ns模拟，分析结合稳定性、能量及构象变化；3) 体外细胞实验：采用MTT法检测化合物对MCF-7乳腺癌细胞和MCF-10A正常乳腺细胞的细胞毒性（单剂量及五剂量IC₅₀测定）；4) 酶活性抑制试验：使用VEGFR-2 Kinase Inhibition Assay Kit（BPS Bioscience）评估化合物对VEGFR-2激酶的半数抑制浓度(IC₅₀)；5) 体内抗肿瘤实验：通过实体埃利希癌(SEC)小鼠模型（样本来源：小鼠移植瘤）评估伊曲康唑的肿瘤抑制效果，包括肿瘤体积/重量测量、血常规分析及组织病理学检查。

2.1. Docking studies

分子对接研究揭示了30种市场批准的唑类药物与VEGFR-2激酶受体活性位点的结合情况。研究使用了两种蛋白质结构（2WZD为DFG-in主动构象，3U6J为DFG-out非主动构象）以获得更真实和验证的结果。重新对接共结晶配体验证了所应用的对接方案，产生的RMSD值分别为1.28 ?和0.97 ?。大多数测试的唑类药物表现出与VEGFR-2受体的良好结合亲和力，并通过不同的键合相互作用结合。其中，伊曲康唑(ITR)、西格列汀(SIT)、替硝唑(TNZ)、氟康唑(FLU)、氯沙坦(LOS)、丹曲洛林(DAN)和咪康唑(MNZ)显示出 superior 的结合模式和亲和力。伊曲康唑(ITR)的结合亲和力最高，为-11.01 Kcal/mol，优于共结晶配体，预测其具有潜在的VEGFR-2抑制活性。其结合模式显示，ITR通过其1,2,4-三唑-3-酮和哌嗪环与Cys⁹¹⁹和Thr⁹¹⁶形成两个碳氢键，与Cys¹⁰²⁴形成卤键，并与多个疏水残基发生广泛相互作用，其二氯苯基部分还与Arg¹⁰²⁷形成π-阳离子相互作用。

2.2. Cytotoxicity of virtually top-scored azoles against MCF-7 cancer cells in single and five dose concentrations

对七个虚拟筛选出的高分唑类化合物进行了针对乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性测试。在单剂量（100 μg/mL）下，所有化合物均表现出良好的细胞毒性，细胞死亡百分比在64.6%至70.9%之间。基于细胞毒性结果，伊曲康唑(ITR)、西格列汀(SIT)、氟康唑(FLU)和替硝唑(TNZ)显示出最高的细胞毒性谱。进一步测定IC₅₀值显示，ITR对MCF-7细胞表现出有前景的细胞毒性，IC₅₀值为25.74 μM，优于其他化合物（SIT: 183.3 μM, FLU: 260.5 μM, TNZ: 301.0 μM）。值得注意的是，ITR对正常乳腺细胞MCF-10A的IC₅₀值为49.6 μM，显示出良好的安全性窗口。

2.3. VEGFR-2 inhibition activity analysis

为了探究四个高分唑类化合物的作用机制，研究人员使用发光测试试剂盒测量了不同剂量下对VEGFR-2酶的抑制百分比。结果显示，伊曲康唑(ITR)表现出有前景的VEGFR-2抑制活性，IC₅₀值为32.70 μM，与阳性对照索拉非尼(Sorafenib, IC₅₀= 3.84 μM)相比具有一定抑制能力。替硝唑(TNZ)也显示出抑制活性（IC₅₀= 81.9 nM），而西格列汀(SIT)和氟康唑(FLU)的抑制活性较差（IC₅₀分别为103.7 μM和342.6 μM）。

2.4. Molecular dynamics studies

基于上述虚拟和实验生物学结果，抗真菌唑类药物伊曲康唑(ITR)作为一个有前景的靶向VEGFR-2受体的抗癌候选物脱颖而出。为了在分子水平上更深入地理解ITR与VEGFR-2的相互作用，研究人员进行了显式分子动力学模拟。模拟结果表明，与未结合配体的蛋白状态相比，结合配体的VEGFR-2具有更低的RMSD值和更稳定的轨迹，表明配体结合对VEGFR-2的热力学行为产生了有利影响。与共结晶配体相比，ITR在结合位点表现出足够的稳定性，尤其是在铰链区和ATP腺嘌呤结合口袋。结合自由能计算（MM_PBSA）显示，ITR与VEGFR-2的结合主要由疏水范德华力驱动，但其较高的极性溶剂化能可能部分抵消了结合亲和力。残基能量贡献分析揭示了Gly-loop、Cα螺旋、铰链区、催化环和激活环等多个结构模体中的关键残基对结合的重要贡献。

2.5. In vivo anti-tumor activity of itraconazole in Solid Ehrlich Carcinoma(SEC) mice

2.5.1. Tumor size and mass analysis

在动物模型中进一步验证了伊曲康唑(ITR)的抗癌活性。在实体埃利希癌(SEC)小鼠模型中，ITR治疗显示出显著的抗癌效果。与SEC对照组相比，ITR治疗显著降低了肿瘤质量（从469 mg降至237 mg）和肿瘤体积（从420 mm3降至221 mm3），肿瘤抑制率(TIR%)达到47.4%，与索拉非尼治疗组（49.1%）效果相当。此外，ITR治疗还改善了SEC引起的血液学参数异常，包括提高血红蛋白水平（从4.6 g/dL升至6.8 g/dL）和红细胞计数（从3.1x10?/μL升至5.1x10?/μL），并降低了白细胞计数（从9.2x103/μL降至6.7x103/μL）。

2.5.2. Histopathological examination

组织病理学检查显示，SEC对照组肿瘤细胞密集，多形性明显，核分裂象多，血管生成丰富，并伴有中央坏死。ITR治疗后，肿瘤细胞密度降低，凋亡细胞增多（染色质凝聚、胞浆收缩），肿瘤血管系统发育不良，坏死区域扩大，炎症反应增强，纤维母细胞增生，核分裂象减少。索拉非尼治疗组则表现出更显著的肿瘤细胞减少、凋亡增加和血管生成抑制。

2.5.3. Immunohistochemical staining of VEGFR-2-related biomarker(VEGF)

免疫组织化学染色分析VEGF（VEGFR-2活性的生物标志物）的表达。SEC对照组约80-90%的肿瘤细胞呈强阳性表达（IRS评分9-12）。ITR治疗后，VEGF阳性细胞比例降至40-60%，染色强度减弱（IRS评分4-8）。索拉非尼治疗组VEGF表达被深度抑制，阳性细胞仅占10-30%，染色强度弱（IRS评分1-2）。这表明ITR通过抑制VEGF/VEGFR-2信号通路发挥抗血管生成作用。

本研究通过综合的计算模拟、体外和体内实验，证实了药物重定位策略在发现新型抗癌药物方面的巨大潜力。研究表明，上市抗真菌药物伊曲康唑(ITR)能够有效抑制VEGFR-2激酶活性，并在细胞和动物水平上表现出显著的抗乳腺癌效果。其作用机制与抑制肿瘤血管生成密切相关。该研究的意义在于：1) 为乳腺癌治疗提供了一个具有已知药代动力学和安全性数据的候选药物，有望加速临床转化；2) 深入揭示了ITR与VEGFR-2靶点的结合模式和热力学特征，为后续基于ITR结构的优化设计提供了理论依据；3) 突出了药物重定位策略在应对区域性高发疾病（如MENA地区乳腺癌）中的成本效益和快速转化优势。本研究发表于《Scientific Reports》，为老药新用提供了扎实的科学证据，并为开发更具选择性和安全性的VEGFR-2抑制剂指明了方向。