靶向成纤维细胞活化蛋白的LNP-mRNA CAR疗法在实体瘤模型中实现持久消退

《Scientific Reports》：Targeting fibroblast activation protein in solid tumors via LNP-mediated CAR-mRNA delivery promotes durable regression in murine models

本研究针对CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中面临的肿瘤微环境免疫抑制、靶抗原不稳定等挑战，开发了一种基于mRNA-LNP的体内CAR递送系统，通过靶向癌相关成纤维细胞标志物FAP重塑肿瘤微环境。研究证实该策略联合化疗和免疫检查点抑制剂可在多种小鼠实体瘤模型中诱导显著肿瘤消退并建立抗原特异性免疫记忆，同时发现m6A修饰可增强疗效，MIF-CD74轴阻断可改善免疫抑制。该研究为实体瘤免疫治疗提供了可调控的新型策略。

　　

在当代肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法对血液肿瘤展现出革命性疗效，但其在实体瘤治疗中却始终难以突破三重壁垒：肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性、治疗细胞对肿瘤组织的低浸润性，以及靶抗原在肿瘤细胞表面的不稳定性。实体瘤中充斥的癌相关成纤维细胞（CAFs）犹如构筑了一道物理与免疫双重屏障，其中高度表达的成纤维细胞活化蛋白（FAP）成为破局的关键靶点——它广泛存在于CAFs表面，却罕见于正常组织，是改造免疫抑制微环境的理想切入点。

为此，研究团队创新性地将目光投向mRNA-LNP（脂质纳米粒）技术平台。这项因新冠疫苗而广为人知的递送系统，如今被赋予新的使命：在活体内直接将编码FAP特异性CAR的mRNA递送至免疫细胞，实现体内重编程。这种策略摒弃了传统CAR-T疗法繁琐的体外细胞改造流程，通过可控的瞬时表达降低基因整合风险，为实体瘤免疫治疗开辟了更安全、灵活的新路径。

本研究发表于《Scientific Reports》，团队通过系统性实验验证了该策略的有效性。关键技术方法包括：利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析FAP表达与预后的关联；采用体外转录合成FAPCAR mRNA并通过LNP封装；建立多种小鼠实体瘤模型（结直肠癌、三阴性乳腺癌等）及人源肿瘤异种移植（PDX）模型；通过流式细胞术、免疫荧光、生物发光成像等技术评估CAR表达、细胞分布及抗肿瘤效果；结合RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）深入探索疗效优化机制与耐药因素。

研究结果部分揭示了一系列重要发现：

FAP表达预示实体瘤恶性程度

通过分析超过13万个细胞的单细胞图谱，证实FAP主要在CAFs中表达，且其高表达与多种实体瘤患者不良预后显著相关，确立了FAP作为治疗靶点的临床价值。

体外体内验证hFAPCAR表达及生物分布

体外实验显示电转染的脾细胞可有效表达FAPCAR并特异性结合靶蛋白（hFAPCAR转染效率29.7%，mFAPCAR为37.3%）。体内实验证实静脉注射mRNA-LNP后24小时可在脾细胞中检测到CAR表达，且CD8⁺T细胞呈现阳性信号。生物分布实验表明，在免疫缺陷模型中CAR表达细胞主要富集于肿瘤组织，而在免疫健全模型中肿瘤富集程度显著降低，提示宿主免疫系统影响CAR细胞的肿瘤归巢。

mRNA-LNP基础FAPCAR疗法诱导肿瘤消退及长期免疫记忆

在MC38结直肠癌模型中，mRNA-LNP联合5-FU和免疫检查点抑制剂（抗PD-1/CTLA-4抗体）治疗组呈现显著肿瘤抑制效果。类似趋势在4T1（三阴性乳腺癌）、E0771（HER2⁺乳腺癌）和Renca（肾癌）模型中得到验证。再攻击实验显示治愈小鼠对同源肿瘤产生特异性免疫记忆，且组织驻留记忆T细胞（T_RM）可能参与此过程。CD8⁺T细胞清除实验证实其在抗肿瘤中的核心作用。

疗效优化机制的初步探索

m6A修饰增强抗肿瘤效果：在mRNA中引入N6-甲基腺苷（m6A）修饰后，治疗反应加速且更显著，可能与mRNA稳定性及翻译效率提升有关。

MIF-CD74轴限制疗效：对复发肿瘤的单细胞分析发现巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）及其受体CD74高表达，细胞通讯分析提示该通路在CAFs、巨噬细胞与癌细胞间形成免疫抑制轴。中和抗体阻断MIF或CD74可改善肿瘤控制，双靶点阻断效果最优。

PDX模型揭示的转化意义及潜在耐药机制

在结直肠癌PDX模型中，联合表达7SL1 RNA的免疫细胞可增强疗效。转录组分析显示敏感模型（PDX-1）中发育负调控等通路下调，而耐药模型（PDX-2）中胚胎骨骼发育通路激活。进一步分析发现PDX-2中HOX家族转录因子显著富集，ATAC-seq显示其染色质可及性在启动子区域增加，特别是在HOX基因簇附近，提示表观遗传重编程可能介导耐药。

讨论部分深入剖析了本研究的科学价值与应用前景。非靶向LNP虽未特异性靶向T细胞，但仍能通过肿瘤增强渗透滞留（EPR）效应及其他潜在机制（如主动跨细胞运输）在肿瘤部位富集，且CAR结构中的T细胞特异性信号域（CD28/CD3ζ）确保了疗效主要由CAR-T细胞介导。靶向FAP⁺CAFs不仅直接破坏肿瘤基质，还可能通过表位扩散（epitope spreading）间接清除非靶向癌细胞，从而产生旁观效应。研究同时指出，HOX基因的异常活化可能作为疗效预测生物标志物，为联合表观遗传治疗提供思路。

尽管该策略仍需联合化疗与免疫检查点抑制剂，且系统毒性、LNP体内分布等需进一步评估，但本研究无疑为实体瘤CAR-T治疗提供了创新性解决方案。通过整合靶向策略、 epitranscriptomic（表观转录组）优化及免疫调控，展现了mRNA-LNP平台在克服实体瘤治疗挑战中的巨大潜力。