细菌来源的细胞色素P450酶催化甾体侧链裂解机制的发现及其生物催化应用

《Nature Communications》：Unveiling cytochrome P450 enzymes that catalyze steroid side-chain cleavage in bacteria

本研究针对传统甾体药物合成路线长、污染大的问题，通过系统挖掘细菌基因组，首次发现CYP204家族P450酶能够直接催化胆固醇、胆甾烯酮等底物的侧链裂解生成孕烯醇酮(PREG)和孕酮(PROG)。该细菌P450scc采用独特的双向区域选择性C-H活化机制，区别于哺乳动物的顺序羟基化途径。通过理性设计将催化效率提升6.5倍，为甾体药物的绿色生物制造提供了新工具。

　　

在医药领域，甾体激素药物因其抗炎、抗过敏和内分泌调节作用，成为临床应用最广泛的药物类别之一。其中，孕烯醇酮（PREG）和孕酮（PROG）是合成糖皮质激素、盐皮质激素和性激素的关键前体。在哺乳动物体内，这些激素的合成始于胆固醇（CHL）侧链的裂解，该反应由细胞色素P450家族11亚族A成员1（CYP11A1，又称P450scc）催化完成。这是一个三步连续的羟基化过程：胆固醇先被羟基化为22R-羟基胆固醇（22R-HC），再进一步羟基化为20R,22R-二羟基胆固醇（20R,22R-DHC），最后C20-C22键断裂生成PREG。然而，哺乳动物来源的P450scc酶存在膜结合性强、异源表达困难、序列保守性高导致改造难度大等瓶颈，限制了其工业应用。与此同时，传统的甾体药物半合成工艺（如从薯蓣皂苷元出发的Marker降解反应）步骤繁琐且存在环境问题。因此，开发高效、绿色的甾体侧链裂解生物催化剂具有重要的科学意义和工业价值。

自然界中，许多微生物能以甾体化合物作为碳源和能源，暗示其体内存在高效的甾体代谢途径。然而，能够直接催化甾体侧链裂解、类似哺乳动物P450scc功能的细菌酶却一直未被发现。解开这个谜团，不仅能深化我们对微生物甾体代谢的理解，还可能为甾体药物的生物制造带来革命性突破。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，成功揭开了细菌催化甾体侧链裂解的神秘面纱。研究人员通过系统性的基因组挖掘，从265个推测具有甾体降解能力的细菌基因组中，发现了一个全新的细菌细胞色素P450酶家族——CYP204家族。该家族酶能够直接催化胆固醇、植物甾醇以及胆甾烯酮（CHO）的侧链裂解，高效生成PREG和PROG。与哺乳动物P450scc的严格底物特异性和顺序羟基化机制不同，细菌CYP204酶展现出更宽松的底物谱和一种独特的、灵活的双区域选择性C-H活化机制。通过蛋白质晶体结构解析、分子动力学（MD）模拟和理性设计，研究人员进一步阐明了其催化机制，并成功将关键酶CYP204A5的催化效率提升了6.5倍。这一发现不仅揭示了一条此前未知的细菌甾体侧链降解途径，也为开发新一代甾体药物绿色生物合成工艺奠定了坚实基础。

为开展本研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1) 基于已知甾体降解菌基因组（共265个）的系统发育基因组挖掘技术，用于发现候选P450酶；2) 蛋白质结晶与X射线衍射技术，解析了CYP204A3的晶体结构（PDB: 9WAT）；3) 阿尔法折叠3（AlphaFold3）蛋白质结构预测与分子对接，用于模拟酶与底物的相互作用；4) 分子动力学（MD）模拟，分析底物在活性中心的构象动态和关键原子间距；5) 定点突变与迭代饱和突变（SSM）等蛋白质工程技术，用于改造和优化酶活性。

结果

细菌来源P450scc的发现

研究人员最初的目标是寻找能够催化甾体C14位羟基化的可溶性细菌P450酶。他们以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的CYP51（MTCYP51）为探针，在对265个推测的甾体降解细菌基因组数据库进行BLAST搜索后，构建了包含1000个同源序列的系统发育树。从中筛选出8个候选酶（P450-A1至P450-A8）进行实验验证。结果发现，只有P450-A8在以胆甾烯酮（CHO）为底物时表现出明显的活性，其主要产物经鉴定为孕酮（PROG），表明其催化了甾体的侧链裂解反应。进一步实验证实，P450-A8还能以胆固醇（CHL）、链甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇为底物，生成孕烯醇酮（PREG），显示出比哺乳动物P450scc更宽的底物特异性。该酶后被命名为CYP204A2。通过进一步的同源序列搜索和系统发育分析，研究人员从假单胞菌门（Pseudomonadota）和杆菌门（Bacillota）中鉴定出192个同源蛋白，并从中选择了9个代表酶（CYP204A3-A6, CYP204B2, CYP204C1, CYP204D1, CYP204E1, CYP204F1）进行功能表征，其中多个酶被证实具有侧链裂解活性。

细菌来源P450scc产生的羟基化中间体的确定

研究人员选择催化效率最高的CYP204A5进行深入的生化表征和机理研究。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，在CYP204A5催化CHO的反应中检测到两个单羟基化中间体和一个二羟基化中间体。通过化学合成标准品比对，确定这两个单羟基化中间体分别为20S-羟基胆甾烯酮（20S-HCO）和22R-羟基胆甾烯酮（22R-HCO）。中间体验证实验表明，只有20S-HCO和22R-HCO能被CYP204A5进一步转化为PROG。放大反应和核磁共振（NMR）鉴定确认二羟基化中间体为20R,22R-二羟基胆甾烯酮（20R,22R-DHCO）。在以胆固醇衍生物为底物的实验中，CYP204A5能有效将22R-羟基胆固醇（22R-HC）、20R,22R-DHC和20S-羟基胆固醇（20S-HC）转化为PREG，但对20R-HC无活性。这些结果表明，细菌P450scc与哺乳动物P450scc共享二羟基化驱动的C-C键裂解机制，但在羟基化顺序和区域选择性上存在差异：哺乳动物CYP11A1严格遵循C22→C20的顺序羟基化，而细菌CYP204家族酶则采用更灵活的双向羟基化机制，初始羟基化可发生在C20或C22位。

P450scc的结构表征

研究人员成功解析了CYP204A3（与CYP204A5序列一致性为70.3%）的晶体结构（分辨率2.1 ?，PDB: 9WAT）。该结构呈现出典型的细菌P450三角棱柱折叠。AlphaFold3对CYP204A3的预测结构与实验结构高度吻合。分子对接将CHO和CHL分别对接到CYP204A3的活性位点，揭示了其底物结合口袋的结构和相互作用模式与哺乳动物CYP11A1-胆固醇复合物（PDB: 3N9Y）存在明显差异。比较分子动力学模拟显示，CYP204A3复合物中配体和活性位点的均方根偏差（RMSD）波动更大，表明其活性位点具有更强的可塑性，这可能与其更宽的底物范围有关。模拟还显示，在整个模拟过程中，CHO的C20和C22始终靠近化合物I（Cpd I）的铁-氧中心，这种空间排布有利于C20和C22的同时羟基化，这与哺乳动物P450scc的顺序羟基化机制不同。对活性口袋5?范围内的关键氨基酸残基（S80, M81, F84, Y93, S94, L253, W256, A257, T261）进行定点突变，证实了它们在底物结合和维持催化构象中的关键作用。

增强细菌P450scc活性关键残基的鉴定

为了提升细菌P450scc酶的催化性能，研究人员对催化口袋内的氨基酸差异进行了比较分析，并针对CYP204A5底物结合口袋5?范围内的22个残基进行了全面的饱和突变。筛选发现，S91、T323和M324位点的突变能显著增强催化活性，其中八个单点突变体（S91M, S91I, T323V, T323L, T323C, T323I, M324L, M324I）的PROG产量比野生型提高了3.5至6.5倍。分子动力学模拟表明，这些有益突变通过引入空间位阻或增强疏水相互作用，使底物CHO的C20和C22原子更稳定地靠近Cpd I的铁-氧中心，从而促进了更高效的催化转化。

结论与讨论

本研究首次在细菌中鉴定并表征了具有甾体侧链裂解活性的CYP204家族P450酶，揭示了一条区别于传统多酶系统的、由单酶催化的细菌甾体侧链降解新策略。该发现不仅拓展了我们对微生物甾体代谢生态学和机制多样性的认知，也为甾体药物的绿色生物制造提供了极具潜力的工具酶。

研究表明，细菌P450scc酶在催化机制上与其哺乳动物同源物存在显著分歧。哺乳动物CYP11A1通过严格的、顺序的C22到C20羟基化进行催化，而细菌CYP204酶则利用其扩大的底物结合口袋所赋予的构象灵活性，采用了一种动态的C-H活化机制，允许C20和C22的同时羟基化。这种机制上的灵活性可能是细菌酶具有更宽底物谱的原因。

在应用潜力方面，细菌P450scc酶因其可溶性表达、优异的工程可塑性以及已被证实的催化效率提升潜力（通过理性设计最高提升6.5倍），展现出远比哺乳动物P450scc更优越的生物技术应用前景。它们为开发直接、高效的孕烯醇酮和孕酮生物合成路线，从而替代或补充现有的多步化学半合成工艺，提供了可持续的解决方案。

综上所述，这项研究不仅发现了一类新的细菌P450scc酶，阐明了其独特的催化机制，还通过蛋白质工程成功提升了其性能。这些酶在基础微生物代谢研究和工业生物催化领域均具有重要价值，为甾体激素的绿色生产和环境生物技术应用开辟了新的道路。