靶向抗原与FcγRIIb的双特异性嵌合体（FcRTAC）介导胞外可溶性蛋白及病理性聚集体的降解新策略

《Nature Communications》：Chimeras co-targeting antigens and FcγRIIb trigger degradation of extracellular soluble proteins and pathological aggregates

本研究针对传统抗体疗法因抗原高负荷及FcRn介导的抗体-抗原复合物回收而疗效受限的问题，开发了FcγRIIb靶向嵌合体（FcRTAC）平台。该平台通过双特异性抗体设计，一端结合病原性抗原，另一端结合FcγRIIb，利用该受体的内吞特性将抗原靶向至溶酶体降解。研究证实FcRTAC可有效清除IgE、PCSK9及Aβ等多种靶点，并在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中通过AAV递送Aβ靶向FcRTAC，实现了持续的Aβ清除和认知功能改善。该研究为从自身免疫病到神经退行性疾病等多种疾病的治疗提供了通用性治疗平台。

　　

在生物医学领域，单克隆抗体药物已经成为治疗癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病等重要武器。它们通过特异性结合并中和病原性抗原（如细胞因子、病原体蛋白或异常表达的膜蛋白）来发挥治疗作用。例如，阿达木单抗（Adalimumab）中和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以缓解类风湿关节炎等疾病的进展；奥马珠单抗（Omalizumab）通过结合游离的免疫球蛋白E（IgE），阻断其与高亲和力IgE受体（FcεRI）的结合，用于治疗中重度过敏性哮喘；而近期获批的仑卡奈单抗（Lecanemab）能特异性结合阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）患者脑内的β淀粉样蛋白（Aβ）寡聚体和原纤维，减缓早期AD患者的认知功能下降。

然而，传统抗体疗法存在其固有的局限性。首先，其疗效受制于化学计量学结合特性，即一个抗体分子通常只能结合有限数量的抗原分子。当体内抗原水平过高时，需要施用超大剂量的抗体才能实现完全中和，这不仅增加了治疗成本，也可能带来更高的不良反应风险。例如，治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿的依库珠单抗（Eculizumab）推荐剂量高达每两周约1000毫克。其次，抗体与抗原结合后形成的免疫复合物，可能通过新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环途径被细胞回收，反而延长了抗原在体内的半衰期，导致抗原积累，这与治疗初衷背道而驰。

为了突破这些限制，科学家们致力于开发胞外靶向蛋白降解（extracellular Targeted Protein Degradation, eTPD）技术。这类技术的核心目标是不仅中和抗原的活性，更能将抗原引导至细胞内（如溶酶体或蛋白酶体）进行彻底降解。早期的探索包括Igawa团队开发的“清除抗体”（sweeping antibody）技术，其利用pH依赖性抗原结合和Fc工程化改造，使抗体在血浆中性pH下结合抗原，在酸性内吞囊泡中解离，从而将抗原送入溶酶体降解，而抗体自身则通过FcRn回收再利用。Bertozzi团队则开创了溶酶体靶向嵌合体（LYTAC），通过将识别特定回收受体（如无唾液酸糖蛋白受体ASGPR或阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体CI-M6PR）的糖配体与靶向抗原的抗体进行生物偶联，利用这些受体的高效内吞作用将胞外蛋白送入溶酶体。此外，还有诸如抗体-蛋白降解靶向嵌合体（AbTAC）和蛋白降解靶向抗体（PROTAB）等平台，它们通过募集膜结合的E3泛素连接酶来降解细胞表面蛋白。

尽管eTPD策略展现出巨大潜力，但各类技术仍存在挑战，例如清除抗体可能受血液中高浓度天然免疫球蛋白的竞争性抑制，LYTAC的生物偶联生产工艺复杂，而AbTAC/PROTAB主要针对膜蛋白，对分泌性蛋白和胞外聚集物效果有限。此外，许多eTPD分子在完成内吞后自身也会被降解，导致半衰期较短。因此，开发一种高效、通用、可基因编码且能降解多种类型胞外蛋白（包括可溶性蛋白和病理性聚集体）的新平台具有重要的科学意义和临床价值。

在此背景下，南开大学/上海科技大学张洪凯团队及其合作者在《Nature Communications》上发表了一项研究，提出了名为FcγRIIb靶向嵌合体（FcγRIIb-Targeting Chimera, FcRTAC）的新型eTPD平台。FcRTAC的设计类似于双特异性抗体，其一个臂（抗原结合片段Fab）特异性结合病原性抗原，另一个臂（单链可变片段scFv）则靶向结合免疫细胞表面一种名为FcγRIIb（Fc gamma receptor IIb）的受体。FcγRIIb是FcγR家族中已知的唯一抑制性受体，它不仅在B细胞上表达，也在髓系细胞如单核/巨噬细胞和小胶质细胞上表达，并具有内吞活性。通过同时结合抗原和FcγRIIb，FcRTAC能够“劫持”该受体的内吞途径，将抗原-FcRTAC-FcγRIIb三元复合物内化到细胞内部，并最终运输到酸性的溶酶体中。在溶酶体环境中，如果抗原结合臂是pH敏感型的（即在酸性条件下结合能力减弱），抗原便会从FcRTAC上解离，随后被溶酶体内的各种水解酶彻底降解。而FcRTAC本身则有可能随着FcγRIIb受体再循环至细胞膜表面，进行下一轮的抗原捕获和降解，从而实现催化性的、可持续的抗原清除。

为开展研究，作者首先通过噬菌体展示技术从人源scFv文库中筛选出能特异性结合人FcγRIIb胞外区的抗体片段，并从中优选出内吞效率最高的两个克隆（SK3和SK4）。接着，他们将筛选到的FcγRIIb结合scFv与不同靶点的抗体（如靶向IgE的NK-2-12、靶向PCSK9的300N/L30H、靶向Aβ的Lecanemab）通过基因工程方法融合，构建成一系列FcRTAC分子。研究过程中，作者综合运用了表面等离子共振（SPR）分析结合亲和力与动力学，流式细胞术和活细胞成像分析内吞效率，免疫荧光显微镜观察亚细胞定位，以及X射线晶体学解析蛋白质复合物结构等关键技术。动物实验则使用了人源化FcγRIIb小鼠、FcγRIIb基因敲除小鼠、人源化PCSK9小鼠以及5xFAD（阿尔茨海默病）模型小鼠等，通过静脉或脑室内注射给药，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学/免疫荧光、蛋白质印迹（Western Blot）以及Y迷宫、新物体识别（NOR）等行为学测试，系统评估了FcRTAC在体内的药代动力学、靶标清除效率、以及对病理改变和认知功能的改善作用。

筛选诱导内吞的FcγRIIb结合抗体

研究人员利用人源scFv噬菌体展示库筛选能够结合人FcγRIIb胞外区的抗体。经过结合力和表达量评估，最终筛选出八个候选scFv，并将其转化为Fc融合蛋白（SKX-Fc）进行表征。通过在人脐静脉内皮细胞（Huvec）中稳定表达人FcγRIIb（Huvec-2b细胞系），证实了这些SKX-Fc能够结合细胞膜上天然构象的FcγRIIb。进一步的内吞实验显示，所有八个SKX-Fc均能被内化，其中SK3-Fc和SK4-Fc的内吞效率最高，因此被选为后续构建FcRTAC的FcγRIIb结合臂。

FcRTACs的设计与表征

研究人员设计了基于双特异性抗体格式的FcRTAC。他们探索了不同的分子构型，发现将FcγRIIb结合scFv（SK3或SK4）融合到靶标抗体（如pH敏感型IgE抗体NK-2-12）重链的C末端（FcRTAC-1构型）时，其诱导Huvec-2b细胞内吞的效率最高，表明两个FcγRIIb结合臂的近距离排列有助于受体簇集和高效内吞。成功构建并纯化了NK-2-12-SK3和NK-2-12-SK4，证实它们能同时结合IgE和FcγRIIb，并能有效促进Huvec-2b细胞对IgE的摄取和降解。

FcRTAC可快速清除血浆靶标且其清除效率因pH敏感型抗原结合而增强

在体外人源化FcγRIIb小鼠模型中，评估了靶向IgE的FcRTAC（NK-2-12-SK3/SK4，pH敏感型）与传统抗体（Omalizumab，pH不敏感型）及其对应的FcRTAC（Omalizumab-SK3/SK4）的清除效率。结果显示，Omalizumab治疗虽然降低了游离IgE，但由于FcRn介导的回收作用，总IgE水平显著升高。而Omalizumab-SK3/SK4则避免了总IgE的积累。更重要的是，pH敏感型的NK-2-12-SK3和NK-2-12-SK4能更快速、彻底地清除总IgE和游离IgE，使其降至检测限以下。在FcγRIIb基因敲除（FcγRIIb^-/-）小鼠中，FcRTAC的IgE清除作用被显著削弱，证实其功效依赖于FcγRIIb受体。药代动力学分析显示，FcRTAC（NK-2-12-SK3）的血浆半衰期短于Omalizumab，且更易分布于表达FcγRIIb的器官（如肝脏）。研究还将FcRTAC平台应用于另一个靶点PCSK9，构建了pH不敏感型（300N-SK3）和pH敏感型（L30H-SK3）的PCSK9靶向FcRTAC，并在人源化PCSK9小鼠模型中证实了其清除血浆PCSK9的能力，其中pH敏感型L30H-SK3效果最佳。

靶向Aβ的FcRTAC促进小胶质细胞介导的病理性Aβ清除

通过分析小鼠脑单细胞测序数据，发现小胶质细胞和脑内巨噬细胞高表达FcγRIIb。据此，研究人员构建了靶向Aβ的FcRTAC（Lecanemab-SK3, Lec-SK3）。体外实验表明，Lec-SK3能有效促进小胶质细胞对荧光标记Aβ的内吞。在5xFAD AD模型小鼠中，脑室（i.c.v.）注射Lec-SK3或对照抗体Lecanemab N297A突变体（Lec）一周后，行为学测试（Y迷宫、新物体识别）显示，Lec-SK3能更有效地改善小鼠的工作记忆和识别记忆。组织学分析进一步表明，Lec-SK3治疗显著降低了海马区的Aβ斑块负荷和小胶质细胞增生（过度激活），并恢复了与突触功能密切相关的微管相关蛋白2（MAP2）和突触后密度蛋白95（PSD95）的表达水平，表明其具有神经保护作用。在野生型（WT）、FcεRΙγ链缺陷（Fcer1g-KO）和FcγRIIb^-/-小鼠中共同脑室注射Aβ寡聚体和Lec-SK3的实验证实，Lec-SK3的认知改善作用依赖于FcγRIIb，而不依赖于激活型FcγR（需要FcεRΙγ链）。

通过AAV载体递送靶向Aβ的FcRTAC可改善Aβ病理模型小鼠的学习行为和病理

为解决抗体难以透过血脑屏障（BBB）的问题，研究人员利用能够高效穿透BBB的腺相关病毒血清型AAV-PHP.eB，构建了表达Lec（AAV-Lec）或Lec-SK3（AAV-Lec-SK3）的病毒载体。在5xFAD小鼠模型中，无论是脑室注射还是静脉注射AAV-Lec-SK3，均能在注射后20天和60天显著改善小鼠的Y迷宫和NOR行为学表现，而AAV-Lec效果有限。值得注意的是，在WT小鼠中脑室注射AAV-Lec-SK3后，在脑组织中检测不到表达的蛋白，而在FcγRIIb^-/-小鼠中则可检测到，说明表达的Lec-SK3在WT小鼠脑中通过结合FcγRIIb被快速内吞清除。组织病理学分析证实，AAV-Lec-SK3治疗（静脉注射）能显著降低海马Aβ_1-42水平、减少Aβ斑块和活化小胶质细胞数量，并提升MAP2和PSD95蛋白水平，效果优于AAV-Lec。

FcRTAC的作用机制研究

利用药理学抑制剂，研究人员探讨了FcRTAC的内吞机制。发现NK-2-12-SK3和NK-2-12-SK4的内吞主要依赖于网格蛋白（clathrin）介导的内吞途径。免疫荧光显微镜观察显示，FcRTAC处理后的细胞中，IgE与溶酶体标记物存在共定位，证实抗原被导向溶酶体降解。有趣的是，两种FcRTAC的胞内命运不同：NK-2-12-SK3更多定位于细胞膜和内吞体，与FcγRIIb受体共定位明显，提示其可能随受体再循环；而NK-2-12-SK4则更多进入溶酶体降解。FcγRIIb受体本身主要定位于细胞膜和内吞体，未在溶酶体中检测到，表明受体本身被循环利用。

结合亲和力成熟的FcγRIIb结合臂的FcRTAC展现出持续抗原清除效率

序列比对和竞争性SPR实验表明，SK3和SK4识别FcγRIIb上重叠的表位。通过X射线晶体学解析了SK4 Fab与FcγRIIb胞外区的复合物结构（PDB ID: 9M5B），揭示了其结合界面。基于结构信息，研究人员对SK3进行亲和力成熟（获得SK3hi变体）和pH敏感性改造（获得SK3ph变体）。SK3hi在酸性内吞体环境下对FcγRIIb的亲和力更高，其构建的FcRTAC（NK-2-12-SK3hi）更倾向于定位于细胞膜而非溶酶体。在小鼠再次攻击实验中，NK-2-12-SK3hi展现出比NK-2-12-SK3更持久的IgE清除能力。而pH敏感型变体SK3ph构建的FcRTAC（NK-2-12-SK3ph）则因其在酸性条件下与FcγRIIb结合减弱，可能更利于通过FcRn途径回收，从而表现出更长的体内半衰期。

FcRTAC与清除抗体技术及ASGPR靶向降解剂的比较

研究人员还将FcRTAC与另一种eTPD策略——清除抗体（构建了NK-2-12-V12，一种pH依赖性且Fc经工程化增强结合人FcγRIIb的抗体）进行了比较。内吞实验表明，NK-2-12-V12的内吞效率低于NK-2-12-SK3，且其内吞机制涉及网格蛋白、巨胞饮和吞噬多种途径。免疫荧光显示，NK-2-12-V12处理下，IgE主要位于细胞膜，溶酶体共定位较少，而NK-2-12-SK3则能有效将IgE招募至溶酶体。在体清除效率上，两者在5 mg/kg剂量下效果相当，但清除抗体NK-2-12-V12具有更长的血清半衰期。研究人员也筛选了ASGPR的结合抗体，并构建了相应的双特异性降解剂（如NK-2-12-AT5），其在体清除IgE的效果略逊于FcRTAC NK-2-12-SK3。

综上所述，这项研究成功开发了FcRTAC这一新型eTPD平台。该平台的核心优势在于其模块化的双特异性抗体设计，能够将几乎任何传统中和抗体转化为高效的抗原降解剂，靶标范围覆盖可溶性蛋白（如IgE, PCSK9）和病理性聚集体（如Aβ）。研究不仅证明了FcRTAC在多种疾病模型中的有效性，特别是通过AAV介导的脑内递送为阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的治疗提供了新思路，还深入揭示了其分子作用机制，包括内吞途径、胞内运输命运以及决定其效能和药代动力学的关键因素（如FcγRIIb结合臂的亲和力和pH敏感性）。这些发现为优化FcRTAC设计（例如通过亲和力成熟或pH敏感性工程化改造）提供了明确方向。尽管FcRTAC存在因靶向介导的药物处置（TMDD）导致半衰期较短的挑战，但研究也指出了通过调控FcγRIIb结合特性来平衡清除效率和半衰期的潜在策略。此外，研究观察到Lec-SK3在有效清除Aβ的同时并未引起持续的小胶质细胞过度激活，这提示FcγRIIb途径可能以一种相对“温和”的方式激活小胶质细胞的清除功能，对于减少神经炎症副作用具有积极意义。总之，FcRTAC平台展现出了作为治疗从自身免疫性疾病到神经退行性疾病等多种疾病的巨大转化潜力，同时也为基础研究中实现胞外蛋白的“敲除”提供了强大的工具。