MCARE通过增强SERCA1活性调控快缩肌钙稳态与肌肉完整性

《Nature Communications》：MCARE enhances SERCA1 activity in fast-twitch muscle to maintain calcium handling and muscle integrity

本研究揭示了跨膜蛋白MCARE在快缩肌中通过竞争性抑制肌调节蛋白（MRLN）来增强肌浆/内质网钙ATP酶1（SERCA1）的活性，从而加速胞质钙回收、促进肌肉舒张。Mcare基因敲除小鼠表现出进行性肌肉萎缩、肌力下降、血清肌酸激酶（CK）升高、波纹样肌肉收缩及运动诱导损伤加剧等肌营养不良样表型。该研究确立了MCARE是维持快缩肌纤维功能完整性的关键调节因子，为理解钙稳态失调相关肌病提供了新视角。

　　

肌肉的收缩与舒张是生命活动的基础，这一过程由钙离子（Ca²⁺）精密调控。当运动神经元发出信号，肌细胞膜去极化，引发肌浆网（SR）通过兰尼碱受体（RyR）释放储存的钙离子，胞质内钙浓度骤升，触发肌动蛋白与肌球蛋白相互作用，肌肉收缩。随后，肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）需高效地将胞质钙离子泵回肌浆网，使肌肉得以放松，准备下一次收缩。SERCA如同肌肉的“钙回收泵”，其活性直接决定了肌肉舒张的速度和效率。在快缩肌（如四肢肌肉）中，其主要亚型是SERCA1。已有研究发现，一些小分子微肽可直接调控SERCA活性，例如，主要在快缩肌表达的肌调节蛋白（MRLN）能够抑制SERCA1的功能。然而，是否存在相应的正向调节机制来平衡这种抑制，从而精细调控快缩肌的钙循环，仍是一个待解的科学问题。

为了解决这一难题，由Takashi Sasaki、Hayataka Takase、Michinori Koebis、Atsu Aiba、Yu Takahashi、Yoshio Yamauchi和Ryuichiro Sato组成的研究团队，在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们发现了一个主要在快缩肌中表达的小型跨膜蛋白——MCARE（肌肉富集钙调节因子）。该蛋白能够与SERCA1结合，并通过竞争性置换其抑制性微肽MRLN来增强SERCA1的泵活性，从而加速肌肉舒张，维持快缩肌的钙稳态和结构功能完整性。Mcare基因敲除（KO）小鼠则表现出类似肌营养不良的症状，包括进行性肌肉萎缩、肌力减弱、血清肌酸激酶（CK）水平升高以及对运动损伤的敏感性增加，尤其值得注意的是，这些小鼠还出现了独特的波纹样肌肉收缩现象。这项研究不仅鉴定了一个新的SERCA1调节因子，也为了解钙稳态失调如何导致肌肉疾病提供了新的机制见解和潜在的动物模型。

为开展此项研究，作者团队运用了多种关键技术方法。研究材料主要涉及C2C12成肌细胞、HEK293细胞、小鼠原代肌管以及通过CRISPR/Cas9技术构建的Mcare基因敲除小鼠模型。关键技术包括分子生物学技术（如质粒构建、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀Co-IP）、细胞生物学技术（如钙成像、细胞运动分析、腺病毒转导、微分透化法确定蛋白拓扑结构）、蛋白相互作用分析（分子对接模拟、SERCA活性测定）以及小鼠模型表型分析（如跑步机耐力测试、握力测试、肌肉组织学分析、心脏毒素诱导的肌肉损伤再生模型）。

MCARE是快缩肌特异性的跨膜蛋白

研究人员首先通过生物信息学分析发现，Mcare基因在脊椎动物中高度保守，其编码的蛋白MCARE属于具有两个跨膜结构域的dispanin蛋白家族。组织分布分析显示，Mcare的mRNA和蛋白在富含快缩肌纤维的腓肠肌、股四头肌等组织中高表达，而在富含慢缩肌纤维的比目鱼肌中表达较低。其表达模式与SERCA1及其抑制性微肽MRLN高度一致，且不在分离出的卫星细胞、巨噬细胞等肌内单核细胞中表达，提示其功能特异性地存在于肌纤维中。亚细胞定位实验表明，无论是外源性表达的EGFP-MCARE还是内源性的MCARE，均与mCherry-SERCA1a共定位于肌浆网，形成典型的横纵纹状结构。通过微分透化法进一步确定，MCARE的N端朝向肌浆网腔，这与SERCA1a的N端朝向胞质侧相反。

MCARE抑制EPS诱导的细胞内Ca²⁺上调并促进肌肉舒张

为了探究MCARE的功能，研究者在C2C12肌管中过表达MCARE，并利用电脉冲刺激（EPS）模拟神经兴奋，同时监测细胞内钙动态和肌管收缩运动。钙成像结果显示，MCARE的表达显著降低了EPS诱导的胞质钙荧光信号的最大振幅（Max △F/F₀），并且在强刺激下，钙信号衰减的时间常数（tau）显著缩短，表明MCARE加速了胞质钙的清除。运动分析进一步揭示，表达MCARE的肌管其收缩位移和最大收缩/舒张速度均有所下降。然而，当使用协方差分析（ANCOVA）将收缩位移作为协变量进行校正后，发现MCARE特异性地增加了肌肉的舒张速度，并显著缩短了半舒张时间（T₅₀），而对收缩速度无显著影响。使用SERCA抑制剂毒胡萝卜素（thapsigargin）处理肌管，可模拟出舒张速度显著受损的表型，印证了MCARE的作用与SERCA活性密切相关。

MCARE与SERCA1a结合并竞争性抑制MRLN

机制探索表明，MCARE与SERCA1a之间存在直接的物理相互作用。分子对接模拟提示，MCARE的第二个跨膜结构域可能结合在SERCA1分子表面一个由跨膜螺旋形成的沟槽中，而该位置恰好也是MRLN的结合位点。竞争性免疫共沉淀实验证实，MCARE能以剂量依赖的方式抑制EGFP-MRLN与Flag-SERCA1a的结合。更重要的是，在体外SERCA活性测定实验中，MCARE本身不改变SERCA1a的基础活性，但能够有效逆转MRLN对SERCA1a的抑制作用，从而恢复钙泵功能。

Mcare缺失损害体内钙处理并诱导肌肉功能障碍

为了验证MCARE的体内功能，研究者构建了Mcare基因敲除（KO）小鼠。与过表达结果相反，KO小鼠的原代肌管在EPS刺激下表现出更强的钙响应和延迟的肌肉舒张（T₅₀延长）。在体研究表明，KO小鼠随着月龄增长，出现进行性肌肉萎缩（尤其在近端肌肉如股四头肌）、握力下降、血清CK水平升高以及肌肉纤维横截面积减小。组织学检查发现KO小鼠肌肉中出现中央核纤维和空泡，并伴有肌肉再生相关基因（如Myogenin, MyHC3, Mustn1）的表达变化，提示存在持续的肌肉损伤与修复。一个非常显著的表型是，当剥离KO小鼠皮肤对肌肉进行机械刺激时，可诱发持续约150秒的波纹样肌肉收缩，这种现象即使在完全离体的后肢肌肉中也存在，类似于人类波纹肌肉病（RMD）的特征，且与运动神经元动作电位无关。

Mcare缺失增加骨骼肌对运动诱导损伤的易感性

尽管KO小鼠在力竭跑步测试中表现出与野生型（WT）相当的耐力，但在进行30分钟亚最大强度跑步运动后，其血清CK水平显著更高，且快缩肌（股四头肌、胫骨前肌）中应激诱导转录因子3（Atf3）的mRNA水平在运动后异常升高，而在慢缩肌（比目鱼肌）中无此差异，表明MCARE缺失特异地增加了快缩肌对运动应激的敏感性。然而，在心脏毒素（CTX）诱导的急性肌肉损伤再生模型中，WT和KO小鼠的再生过程没有显著差异，提示MCARE缺失导致的肌肉病理更可能源于日常活动中钙处理异常累积的损伤，而非再生能力本身缺陷。

综上所述，本研究首次鉴定并深入探讨了跨膜蛋白MCARE在快缩骨骼肌中的关键作用。MCARE通过结合SERCA1并拮抗其抑制性微肽MRLN，充当了SERCA1活性的正向调节器，确保肌肉在收缩后能够快速有效地舒张，维持正常的钙循环。Mcare的缺失破坏了这一精细平衡，导致胞质钙清除延迟，钙稳态失调，进而引发一系列肌营养不良样病理变化，包括进行性肌萎缩、肌力减弱、运动易损性增加以及独特的波纹样肌肉收缩。这些发现不仅揭示了快缩肌纤维类型特异性钙调控的一个新机制，也将MCARE与人类疾病如Brody肌病（SERCA1突变导致）和波纹肌肉病联系起来。Mcare KO小鼠，特别是其表现出的RMD样表型，为研究这类罕见肌病的发病机制提供了宝贵的动物模型。未来的研究可以进一步探索MCARE调控下游的具体信号通路，以及靶向MCARE-SERCA1轴是否能为改善肌肉功能、治疗相关肌病提供新的策略。