PIL1转录因子调控关键谷物淀粉合成新机制及其育种应用

《Nature Communications》：The bHLH transcription factor PIL1 orchestrates starch synthesis in key cereal crops

本研究针对谷物淀粉合成调控网络不明确的问题，聚焦bHLH转录因子PIL1的功能解析。研究人员发现TaPIL1-5D通过直接结合TaAGPS1a-7A、TaGBSSI-4A和TaBEIIb-2D等淀粉合成关键基因启动子区的E-box motif，激活其表达进而正向调控淀粉积累和千粒重。该机制在水稻OsPIL11和玉米ZmPIL1中高度保守。研究还鉴定到TaPIL1-5B启动子区优异单倍型（Hap2/3）可规避TaBZR1.1抑制并增强TaPIL1-5D转录活性，为谷物产量和淀粉含量改良提供了重要靶点。

　　

谷物作为人类的主要能量来源，其产量提升对于保障全球粮食安全至关重要。淀粉作为谷物籽粒的主要成分，占小麦籽粒重量的70%以上，直接影响千粒重和最终产量。然而，淀粉合成的转录调控网络，尤其是在重要谷物小麦中，仍有许多未知之处。以往研究虽然鉴定出一些参与淀粉合成的关键酶，如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、颗粒结合淀粉合成酶I(GBSSI)和分支酶IIb(BEIIb)，但调控这些基因表达的上游转录因子及其作用机制尚不清晰。阐明这一调控网络，对于通过分子育种手段提高谷物产量和品质具有重大意义。近期，发表于《Nature Communications》的一项研究，在小麦、水稻和玉米中揭示了一个名为PIL1的bHLH转录因子在淀粉合成中的核心调控作用。

研究者主要运用了转基因技术（包括过表达和CRISPR/Cas9基因编辑）、酵母单杂交(Y1H)筛选、电泳迁移率变动分析(EMSA)、双荧光素酶报告基因检测、酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光互补成像(LCI)等技术手段。研究材料涉及小麦自然群体（301份种质，包括46份地方品种和255份现代栽培品种）、重组自交系(RIL)群体以及水稻和玉米的转基因株系。

TaPIL1-5D在籽粒中优势表达并识别E-box motif

为了寻找调控淀粉合成的转录因子，研究人员以淀粉合成起始关键酶基因TaAGPS1a的启动子为诱饵，通过酵母单杂交技术筛选小麦cDNA文库，鉴定到一个bHLH家族转录因子TaPIL1-5D。系统进化分析显示，TaPIL1-5D与水稻OsPIL11、玉米ZmPIL1亲缘关系较近。表达分析表明，TaPIL1-5D在发育中的胚乳中表达量显著高于其同源基因TaPIL1-5A和TaPIL1-5B。功能验证证实TaPIL1-5D具有转录激活活性，并能特异性识别并结合E-box (CANNTG) motif，而对突变后的E-box则无结合能力。

TaPIL1-5D调控淀粉积累并提高千粒重

为了明确TaPIL1-5D的功能，研究团队在小麦品种郑麦7698中创建了TaPIL1-5D过表达株系和利用CRISPR/Cas9技术敲除所有三个同源基因（TaPIL1-5A, -5B, -5D）的突变体。田间试验表明，与野生型相比，过表达株系的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量均显著提高，籽粒更长更宽，千粒重和单产也显著增加。相反，三突变体tapil1的淀粉含量、籽粒大小和千粒重均显著下降。这些结果证明TaPIL1-5D是籽粒淀粉合成和粒重的正向调控因子。

TaPIL1-5D结合并激活TaAGPS1a-7A、TaBEIIb-2D和TaGBSSI-4A的表达

基于上述表型，研究人员推测TaPIL1-5D可能激活淀粉合成相关基因的表达。RT-qPCR分析发现，在过表达株系中，多个淀粉合成相关基因（SSREs）的表达上调，而在突变体中则下调。他们进一步聚焦于调控总淀粉、支链淀粉和直链淀粉合成的三个关键基因：TaAGPS1a-7A、TaBEIIb-2D和TaGBSSI-4A。EMSA和Y1H实验证实TaPIL1-5D能直接结合这些基因启动子区的E-box motif。双荧光素酶报告基因实验进一步在体内证明TaPIL1-5D可以激活这些靶基因的转录。

PIL1在水稻和玉米中具有保守的淀粉合成调控功能

为了探究PIL1功能的保守性，研究人员在水稻和玉米中进行了类似研究。发现水稻OsPIL11和玉米ZmPIL1同样能直接结合并激活各自物种中AGPS1、BEIIb和GBSSI同源基因的表达。转基因过表达OsPIL11或ZmPIL1均能提高籽粒的淀粉含量和千粒重。这表明PIL1调控淀粉合成的功能在关键谷物中是保守的。

TaPIL1-5B启动子的等位变异与淀粉含量和千粒重显著相关

对301份小麦自然群体的基因序列分析发现，TaPIL1-5B启动子区存在9个SNP和4个InDel，形成了三种单倍型（Hap1-3），而TaPIL1-5A和TaPIL1-5D则无多态性。启动子活性分析显示，Hap2和Hap3的转录活性高于Hap1。携带Hap2/3的小麦品种在多个环境下表现出更高的TaPIL1-5B及其靶基因表达量、更高的淀粉含量和千粒重。育种历程分析表明，优良单倍型Hap2/3在现代品种中的频率从1980年代的52.7%上升至2020年代的90.7%，说明其在育种过程中受到了正向选择。

TaBZR1.1结合TaPIL1-5B-Hap1启动子并抑制其表达

通过对单倍型间序列差异的分析，发现在Hap1特有的275 bp插入片段中存在一个油菜素内酯响应元件(BRRE)。EMSA和Y1H实验证明，转录抑制因子TaBZR1.1能特异性结合Hap1启动子中的BRRE元件，而对Hap2/3则无结合能力。双荧光素酶实验进一步证实TaBZR1.1抑制Hap1启动子的活性，但不影响Hap2/3。这解释了为何Hap1的转录活性和表达水平较低。

TaPIL1-5B与TaPIL1-5D形成异源二聚体

bHLH转录因子常通过形成二聚体发挥作用。通过Y2H、BiFC和LCI实验，研究人员证实TaPIL1-5B与TaPIL1-5D在体内外均能发生相互作用。更重要的是，双荧光素酶报告基因实验显示，TaPIL1-5B和TaPIL1-5D共表达时，对靶基因的激活能力显著强于单独表达任一基因，表明二者形成的异源二聚体具有协同增强转录活性的效应。

该研究系统地阐明了TaPIL1-5D通过直接激活关键淀粉合成酶基因表达来正向调控小麦籽粒淀粉合成和粒重的分子机制。其功能在稻米和玉米中高度保守。研究首次揭示了TaPIL1-5B自然变异影响其表达的内在机制（受TaBZR1.1抑制），并发现了TaPIL1-5B与TaPIL1-5D通过形成异源二聚体协同增强转录活性的新机制。这些发现不仅丰富了谷物淀粉合成的转录调控网络，而且为通过分子标记辅助选择优良单倍型（如TaPIL1-5B-Hap2/3）或利用基因工程手段调控PIL1表达来改良谷物产量和淀粉品质提供了重要的理论依据和基因资源。