MAASTY：一种用于天然纳米盘中人源膜蛋白高分辨率结构测定的（无序）共聚物

《Nature Communications》：MAASTY: a (dis)ordered copolymer for structural determination of human membrane proteins in native nanodiscs

本研究针对传统膜蛋白结构解析方法中天然脂质丢失和操作复杂等问题，开发了一种新型两亲性共聚物MAASTY（甲基丙烯酸-苯乙烯共聚物）。研究表明，MAASTY能够直接从哺乳动物细胞膜中提取膜蛋白形成"天然纳米盘"，成功解析了人源TRPM4离子通道3.5?的高分辨率冷冻电镜结构，保留了包括胆固醇在内的内源性脂质并富集了磷脂酰肌醇。该共聚物可高效 solubilize 多种真核膜蛋白和脂质成分，为膜蛋白的结构与功能研究提供了新的技术平台。

　　

膜蛋白是细胞生命活动的关键执行者，也是重要的药物靶点。然而，由于膜蛋白具有疏水跨膜区，其结构解析一直面临巨大挑战。传统的结构生物学方法通常需要先用去垢剂将膜蛋白从细胞膜中"剥离"出来，然后再将其重建到人工脂质环境中。这种方法虽然取得了一定成功，但存在明显局限：重建过程中膜蛋白原有的内源性脂质几乎全部丢失，而这些脂质往往对膜蛋白的结构稳定性和功能调节至关重要。

为了在更接近天然状态的环境中研究膜蛋白，科学家们开发了纳米盘技术。其中，"天然纳米盘"方法特别有吸引力——它使用两亲性共聚物直接从细胞膜中"切割"出包含膜蛋白和其周围天然脂质的盘状结构，无需去垢剂处理和人工重建步骤。然而，现有的共聚物（如SMA）存在电荷性强、分子量分布宽等缺点，限制了其广泛应用。因此，开发新型高效的纳米盘形成共聚物成为膜蛋白研究领域的重要方向。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，哥本哈根大学和丹麦技术大学的研究团队报道了一种新型共聚物MAASTY（甲基丙烯酸-苯乙烯共聚物），并证明其能够高效形成天然纳米盘，支持人源膜蛋白的高分辨率结构测定。

研究团队主要运用了可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合、荧光尺寸排阻色谱（FSEC）、单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）、质谱（MS）和脂质组学等关键技术方法。实验使用了重组表达的HEK293细胞膜蛋白样本。

MAASTY的合成与化学特性

研究人员通过RAFT聚合合成了六种不同组成的MAASTY共聚物，并系统表征了其化学性质。与先前开发的AASTY（丙烯酸-苯乙烯共聚物）相比，MAASTY具有更不规则的单体序列分布和更高的疏水性。这种结构差异使得MAASTY具有更宽的pH工作范围（pKa值7.2-8.2）和不同的二价阳离子耐受特性。虽然游离的MAASTY共聚物对Ca²⁺的结合能力较强，但在纳米盘形成条件下，高甲基丙烯酸含量的MAASTY共聚物表现出更好的Ca²⁺和Mg²⁺耐受性。

MAASTY促进膜蛋白高分辨率结构测定

为验证MAASTY在结构生物学中的应用潜力，研究团队选择人源瞬时受体电位M4（hTRPM4）离子通道作为模型蛋白。hTRPM4是一种钙激活的非选择性阳离子通道，与心血管疾病、前列腺癌和中枢神经系统疾病相关。研究发现，MAASTY7.1-50能够高效地从HEK293细胞膜中提取hTRPM4，其效果甚至优于传统的去垢剂DDM-CHS。

通过单颗粒冷冻电镜分析，研究人员成功解析了hTRPM4在MAASTY纳米盘中的结构，整体分辨率达到3.5?。跨膜区、细胞外环、N末端、MHR4区和C末端中央卷曲螺旋结构域清晰可见。尽管细胞质区的MHR1-3结构域由于构象柔性未能解析，但跨膜结构域与之前在MSP纳米盘中解析的结构高度一致。

特别值得注意的是，在hTRPM4-MAASTY结构中观察到了多个脂质密度，其中三个被鉴定为胆固醇分子。这些胆固醇分子位于先前确定的胆固醇结合位点，可能对通道的稳定性和功能调节起重要作用。脂质组学分析进一步证实，hTRPM4-MAASTY纳米盘中富含多种内源性脂质，包括磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）等。有趣的是，PI的相对丰度达到15-25%，远高于质膜中1-2%的正常含量，提示可能存在特异性富集。

另一个重要发现是，在没有外源添加CaCl₂的情况下，hTRPM4的Ca²⁺结合位点观察到了明显的密度，表明MAASTY纳米盘能够保留内源性结合的Ca²⁺离子。这一发现证明了MAASTY在研究二价阳离子敏感膜蛋白方面的应用潜力。

MAASTY solubilize多种膜蛋白

为评估MAASTY的普适性，研究人员测试了其对多种真核膜蛋白的solubilization效果，包括单体结构的兔肌质/内质网Ca²⁺-ATP酶1a（rSERCA1a）、同源二聚体的人钾通道亚家族K成员18（hKCNK18）和同源三聚体的鸡酸敏感离子通道1（cASIC1）。FSEC结果表明，MAASTY能够有效solubilize这些具有不同寡聚化状态的膜蛋白，且对于某些靶点，其效果优于AASTY共聚物。

MAASTY与多种脂质兼容

脂质组成对纳米盘形成效率有重要影响。研究人员测试了MAASTY对三种不同脂质组成的solubilization能力：合成脂质POPC、大豆极性脂质提取物（Soy PLEx）和大肠杆菌极性脂质提取物（E. coli PLEx）。与AASTY主要适用于zwitterionic脂质不同，MAASTY能够有效solubilize各种电荷特性的脂质组成，包括富含负电荷脂质的大肠杆菌脂质提取物。这表明MAASTY具有更广泛的脂质兼容性。

研究结论与意义

本研究开发的MAASTY共聚物为膜蛋白研究提供了新的有力工具。其独特的化学特性（适度的交替性、可控的分子量和组成）使其能够高效形成天然纳米盘，支持高分辨率结构测定。hTRPM4在MAASTY纳米盘中的成功结构解析证明了该技术的实用性，而其对多种膜蛋白和脂质组成的广泛兼容性则展现了其应用潜力。

特别重要的是，MAASTY纳米盘能够保留膜蛋白的内源性脂质环境，这可能对维持膜蛋白的天然结构和功能状态至关重要。研究中观察到的脂质富集现象（如PI的高含量）提示共聚物可能影响特定脂质的提取效率，进而影响膜蛋白的构象均一性和结构解析质量。

该研究不仅提供了一种新型膜蛋白研究工具，也增进了我们对共聚物性质与纳米盘形成之间关系的理解。MAASTY的成功开发表明，通过合理设计共聚物的化学结构（如单体选择、序列分布、疏水性等），可以优化其膜蛋白solubilization能力，为未来开发更高效的纳米盘形成材料提供了重要指导。

随着膜蛋白结构生物学和功能研究的深入，能够在近天然环境中研究膜蛋白的技术平台将变得越来越重要。MAASTY共聚物为代表的新型纳米盘技术，有望推动我们对膜蛋白工作机制的理解，为相关药物开发提供新的结构基础。