靶向胰腺癌相关糖基化修饰：新型糖桥增强CAR-T细胞疗效的策略研究

《Nature Communications》：Tuning CAR-T cells by targeting cancer-associated glycan in pancreatic cancer

本刊推荐：为解决CAR-T细胞在实体瘤中因抗原异质性、免疫抑制微环境及糖萼屏障而疗效受限的问题，研究人员开展了针对癌症相关Tn抗原（特别是Tn-MUC1）的糖桥（glyco-bridge）策略研究。通过将识别Tn-MUC1的非信号传导糖桥整合至靶向间皮素（mesothelin）的CAR-T细胞中，显著增强了其对胰腺癌细胞的识别和细胞毒性。该策略进一步拓展为基于串联Helix pomatia凝集素（HPA）的糖桥，可广谱靶向多种癌症的Tn抗原，在胰腺癌患者来源异种移植（PDX）模型中展现出优越疗效，并有效降低了HPA直接作为CAR靶向域时的脱靶毒性，为克服实体瘤免疫治疗障碍提供了新思路。

　　

在癌症免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-cell, CAR-T）疗法已在血液肿瘤中取得革命性成功，但在胰腺癌等实体瘤中的应用却举步维艰。这背后的主要原因包括肿瘤抗原的异质性、 immunosuppressive tumor microenvironment（免疫抑制性肿瘤微环境），以及一道难以逾越的物理屏障——糖萼（glycocalyx）。这道由密集糖蛋白（如MUC1）构成的“盔甲”在癌细胞表面异常增厚，如同给癌细胞穿上了防弹衣，阻碍免疫细胞的接近和抗原识别，从而大大削弱了CAR-T细胞的攻击效力。尤其值得注意的是，在大多数腺癌（包括胰腺癌）中，一种名为Tn抗原（Tn antigen）的糖基化修饰（由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与丝氨酸或苏氨酸连接而成）会过度表达。其中，被Tn抗原修饰的MUC1（Tn-MUC1）在胰腺癌中尤为常见。如何巧妙地利用这一癌细胞的“糖衣”作为突破口，而非视其为障碍，成为提升CAR-T疗法效果的关键。

针对这一挑战，由Marcela V. Maus领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究。他们设想，能否给CAR-T细胞装备一种特殊的“桥接”工具，使其能先抓住癌细胞表面的糖萼（如Tn-MUC1），从而帮助CAR-T细胞更牢固地锚定在癌细胞上，进而增强其主武器（CAR）对肿瘤抗原（如间皮素(mesothelin)）的识别和杀伤能力？这种新型工具被命名为“糖桥”（glyco-bridge）。为了验证这一想法，研究人员开展了一系列严谨的实验。

本研究的关键技术方法主要包括：利用慢病毒载体构建并表达靶向间皮素的CAR以及各种糖桥（如靶向Tn-MUC1的单链抗体（scFv）桥、靶向CD19的对照桥、以及基于串联Helix pomatia凝集素（HPA）的糖桥）的CAR-T细胞；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除C1GALT1基因或使用伊曲康唑（itraconazole）药物处理，以在胰腺癌细胞系（如Capan-2）中上调Tn抗原表达；通过实时细胞杀伤分析、声学力细胞亲合力测定（z-Movi Cell Avidity Microfluidics System）等技术评估CAR-T细胞功能；利用免疫组织化学（IHC）、流式细胞术和共聚焦显微镜分析靶抗原表达及CAR-T细胞浸润情况；并在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ, NSG）小鼠模型中建立皮下移植瘤模型（包括细胞系和患者来源异种移植(PDX)模型）进行体内疗效和安全性评估。研究所用的人原代T细胞来源于健康供体的白细胞去除术产物，PDX细胞系由合作实验室提供。

研究结果

Glyco-bridge strategy enhances CAR-T cell killing of Tn-MUC1-expressing cancer cells（糖桥策略增强CAR-T细胞对Tn-MUC1表达癌细胞的杀伤）

研究人员首先设计了一种靶向间皮素的CAR，并为其配上了第一个糖桥——一个能识别Tn-MUC1的单链抗体（scFv, 5E5）。作为对照，他们使用了靶向CD19的桥（CD19-bridge），因为CD19在实体瘤中不表达。为了增强实验模型的Tn抗原表达，他们通过CRISPR/Cas9技术敲除了Capan-2胰腺癌细胞中的C1GALT1基因（该基因编码的酶负责将Tn抗原进一步加工成更复杂的糖链，敲除后Tn抗原会累积），或使用伊曲康唑抑制该酶活性。结果表明，与携带CD19-bridge的CAR-T细胞相比，携带Tn-MUC1-bridge的CAR-T细胞对Tn抗原高表达的Capan-2 C1GALT1 KO细胞或伊曲康唑处理的Capan-2细胞展现出更强的杀伤能力。进一步利用声学力细胞亲合力测定技术发现，Tn-MUC1-bridge能显著增加CAR-T细胞与靶细胞之间的结合亲合力（avidity），这为观察到的增强杀伤效果提供了机制解释。

Tn-MUC1 bridge CAR-T cells enhance tumor suppression in Capan-2 mouse models（Tn-MUC1桥CAR-T细胞在Capan-2小鼠模型中增强肿瘤抑制）

在荷瘤（Capan-2野生型、C1GALT1 KO型或伊曲康唑处理）的NSG小鼠模型中，研究人员评估了糖桥策略的体内效果。在Tn-MUC1表达水平相对较低的Capan-2野生型模型中，两种桥接策略的CAR-T细胞抗肿瘤效果无显著差异。然而，在Tn-MUC1表达水平升高的Capan-2 C1GALT1 KO模型或伊曲康唑处理的模型中，携带Tn-MUC1-bridge的CAR-T细胞表现出显著优于CD19-bridge对照组的肿瘤控制能力。更重要的是，对残留肿瘤组织的分析显示，Tn-MUC1-bridge CAR-T细胞在肿瘤内的浸润程度大约是CD19-bridge组的8倍，表明糖桥策略有助于CAR-T细胞突破肿瘤屏障，更有效地浸润到肿瘤内部发挥作用。

Activation of the CAR is dependent on recognition of the bridge‘s antigen（CAR的激活依赖于对桥接分子靶抗原的识别）

一个有趣的发现是，糖桥本身虽然被设计为“非信号传导”（non-signaling），即其本身不激活T细胞，但在特定条件下却能影响CAR的激活。研究人员利用不表达间皮素但可调控桥接靶抗原（CD19或Tn-MUC1）表达水平的细胞模型（如RPMI 8226、Jeko-1）进行探索。他们发现，只有当桥接分子所识别的抗原（如CD19）达到一定密度时，CAR-T细胞的杀伤活性才会被增强。即使CAR本身的靶向scFv被删除，只要CAR的细胞内信号域完整，高密度的桥接靶抗原仍能通过某种机制促进CAR的激活和细胞杀伤。这种激活程度与桥接靶抗原的密度呈幂律关系（power-law dependence），并且受桥接分子与其靶抗原结合亲和力（affinity）的影响。例如，低亲和力的HPA凝集素作为桥接分子时，即使靶抗原密度高，也难以单独触发CAR介导的杀伤，这反而可能成为一种安全特性，避免对正常组织的误伤。

HPA lectin-based CAR-T cells expand the targeting scope of Tn antigens（基于HPA凝集素的CAR-T细胞拓展了Tn抗原的靶向范围）

为了突破Tn-MUC1这一特定糖蛋白的限制，实现更广谱的Tn抗原靶向，研究人员将目光投向了Helix pomatia凝集素（HPA）。HPA能特异性识别Tn抗原的核心结构（GalNAcα1-Ser/Thr），而不依赖于其连接的蛋白骨架（如MUC1、MUC5AC、MUC16等），因此在多种高表达Tn抗原的癌症中具有应用潜力。他们构建了包含单次、双次甚至三次HPA结构域的CAR（HPAx1, HPAx2, HPAx3 CAR）。实验表明，串联HPA结构（尤其是HPAx2）能赋予CAR-T细胞更强的结合亲合力和对Tn抗原高表达细胞（如胰腺癌PDX1294细胞）的体外杀伤能力，其效果优于靶向Tn-MUC1的CAR。然而，在体内实验中，直接使用HPAx2 CAR虽然能有效控制肿瘤，但在部分小鼠中观察到了明显的毒性反应（如体重下降），组织学检查发现HPA-CAR T细胞在肾脏、肺部等正常组织中有非特异性浸润，提示存在on-target/off-tumor（脱靶）毒性风险。

Enhancing CAR-T cell efficacy with dual HPA bridge in PDX models（在PDX模型中利用双HPA桥增强CAR-T细胞疗效）

鉴于HPA作为直接杀伤性CAR的靶向域存在毒性风险，研究人员巧妙地将串联HPA结构（HPAx2）重新设计为糖桥（HPA-bridge），与靶向间皮素的CAR联合使用。这种策略旨在利用HPA对Tn抗原的广谱识别能力来增强CAR-T细胞在肿瘤部位的粘附，而不直接引发强烈的T细胞激活信号，从而在保持疗效的同时提高安全性。在多种胰腺癌PDX模型（如PDX1294高表达Tn抗原和间皮素，PDX1275高表达MUC1，PDX1319抗原表达低）中进行的测试表明，HPA-bridge能根据模型的特异性抗原表达谱，有效增强CAR-T细胞的杀伤效果，特别是在Tn抗原丰富的PDX1294模型中。最重要的是，在之前观察到HPA-CAR毒性的Capan-2 C1GALT1 KO小鼠模型中，使用相同供体T细胞制备的、携带HPA-bridge的间皮素靶向CAR-T细胞，不仅实现了相同甚至更好的肿瘤控制，而且完全避免了此前HPA-CAR所引发的毒性反应。组织浸润分析证实，HPA-bridge CAR-T细胞主要富集在肿瘤组织，而很少浸润到肾脏、肝脏和肺部等正常器官。

结论与意义

本研究成功开发并验证了一种旨在克服实体瘤糖萼屏障的新型CAR-T细胞增强策略——糖桥（glyco-bridge）。该策略的核心在于通过一个非信号传导的糖结合模块（如靶向Tn-MUC1的scFv或靶向通用Tn抗原的HPA凝集素）来增强CAR-T细胞与癌细胞表面的初始粘附，从而提升其主CAR对肿瘤抗原的识别效率和杀伤能力。

研究的重要发现和意义在于：

1. 1.
   机制创新：证实了非信号传导的桥接分子可以通过提高细胞间亲合力来增强CAR-T细胞功能，并且这种增强作用依赖于桥接靶抗原的密度和桥接分子的结合亲和力。这为理解双靶点CAR系统的激活动力学提供了新视角，表明其作用机制可能超越简单的“或门”（OR-gate）逻辑，涉及更复杂的受体聚集和免疫突触稳定过程。
2. 2.
   靶点拓展：首次将广谱识别Tn抗原的HPA凝集素成功应用于CAR-T细胞策略，并证明其作为糖桥模块比作为直接杀伤性CAR的靶向域更具安全性优势，有效解决了lectin（凝集素）类CAR潜在的on-target/off-tumor毒性问题。
3. 3.
   治疗潜力：在临床前胰腺癌模型（包括细胞系和更接近临床的PDX模型）中，糖桥策略（无论是Tn-MUC1特异性还是HPA广谱性）均显示出显著增强的抗肿瘤活性和改善的肿瘤浸润能力，为将CAR-T疗法应用于胰腺癌等难治性实体瘤提供了有希望的新途径。
4. 4.
   安全考量：研究强调了在设计靶向糖抗原的免疫疗法时，需仔细权衡结合模块的亲和力、特异性与安全性。将高亲和力但可能引发脱靶毒性的结合域（如HPA）用作辅助性的桥接分子而非主要杀伤信号触发域，是一种可行的安全策略。

总之，这项研究不仅提出了一种克服实体瘤免疫治疗障碍的创造性方法，而且深化了对CAR-T细胞与肿瘤微环境（特别是糖萼）相互作用的理解，为开发下一代更安全、更有效的实体瘤CAR-T疗法奠定了坚实的基础。未来的研究方向可能包括探索将糖桥与共刺激信号域结合以进一步优化T细胞功能，以及将糖桥策略与其它克服免疫抑制微环境的方法（如基质降解、免疫检查点抑制等）进行联合应用。